[发明专利]一种外膜化心脏类器官制备方法及模型

说明书

本发明涉及类器官技术领域，提出一种外膜化心脏类器官制备方法及模型。外膜化心脏类器官制备方法包括以下步骤：在第一多孔板内对多能干细胞进行分化培养得到心血管前体细胞；对心血管前体细胞进行分化培养得到心外膜谱系细胞；对诱导分化后含有心外膜谱系细胞的心血管前体细胞进行培养获得外膜化心脏类器官。本发明提供的外膜化心脏类器官制备方法能够构建可以高度模拟人体心脏节律性跳动和具有外膜结构的外膜化心脏类器官，所获得的外膜化心脏类器官模型具有多细胞类型和形态复杂性，能够更好地模拟胚胎心脏发育，拥有广阔的应用前景和较高的商业价值。

技术领域

本发明涉及类器官技术领域，尤其涉及一种外膜化心脏类器官制备方法及模型。

背景技术

心脏是哺乳动物胚胎发育过程中形成的第一个功能性器官，心脏发育异常导致的先心病约占活产儿出生缺陷的1％。由于妊娠早期人胚胎心脏样本无法获取，动物模型又存在物种差异，因此，人胚胎早期心脏发育过程仍未知。利用多能干细胞来源的类器官作为发育模型，已经解码了很多器官发育过程中的关键事件，但心脏类器官的研究滞后。

通过混合心肌细胞和其他一些心脏非心肌细胞，比如脐带来源的血管内皮细胞，或是多能干细胞定向分化而来的血管内皮细胞或心脏成纤维细胞等，所构建的心脏类器官可以进行药物筛查和心梗等疾病的模拟，然而，这些模型均未能重现心脏特异性的自我组装和形态发生过程，并且无法获得外膜化的结构。

发明内容

本发明提供一种外膜化心脏类器官制备方法，能够构建具有外膜结构和可以高度模拟人体心脏节律性跳动的外膜化心脏类器官。所获得的外膜化心脏类器官具有多细胞类型和形态复杂性，能够更好地模拟胚胎心脏发育，拥有广阔的应用前景和较高的商业价值。

本发明还提供一种外膜化心脏类器官模型。

根据本发明第一方面实施例提供的外膜化心脏类器官制备方法，包括以下步骤：

在第一多孔板内对多能干细胞进行分化培养得到心血管前体细胞；

在多能干细胞融合度到达40％-60％后，去除培养基，加入第一预定量含有4μmCHIR的RPMI1640+B27培养基，放入培养箱中在第一预定温度下培养第一预定时间，这里将不含胰岛素的RPMI1640+B27培养基称为RB-培养基；

第一预定时间后吸弃上清，向所述第一多孔板的每孔加入第二预定量的RB-培养基，放入培养箱中在第一预定温度下培养第二预定时间；

第二预定时间后吸弃上清，向每孔加入第三预定量含有4μmIWP-2的RB-培养基，放入培养箱中在第一预定温度下培养第一预定时间；

第一预定时间后吸弃上清，向每孔加入第三预定量的RB-培养基，放入培养箱中在第一预定温度下培养第一预定时间；

第一预定时间后吸弃上清，更换含有胰岛素的RPMI1640+B27培养基，放入培养箱中继续培养得到心外膜谱系细胞，这里将含有胰岛素的RPMI1640+B27的培养基记为RB+培养基；

对所述心外膜谱系细胞进行诱导分化；

对诱导分化后含有所述心外膜谱系细胞的心血管前体细胞进行培养。

根据本发明提供的一种外膜化心脏类器官制备方法，所述在第一多孔板内对多能干细胞进行分化培养得到心血管前体细胞的步骤，包括以下步骤：

将富集至80％-90％的多能干细胞消化成小团块，按1:(10-15)的比例传代培养，在第一多孔板内的E8完全培养基中加入5μmY27632培养第二预定时间；

第二预定时间后，更换新鲜的E8完全培养基，放入培养箱中在第一预定温度下培养第二预定时间。

根据本发明提供的一种外膜化心脏类器官制备方法，所述对所述心外膜谱系细胞进行诱导分化的步骤，包括以下步骤：