[发明专利]一种海洋来源放线菌基因遗传操作体系及构建方法

说明书

本发明公开一种海洋来源放线菌基因遗传操作体系及构建方法，该方法包括如下步骤：(1)将人工质粒pSET152通过化学转化法导入大肠杆菌ET12567(pUZ8002)感受态细胞中，得到供体菌株大肠杆菌ET12567(pUZ8002/pSET152)；(2)配置链霉菌孢子悬液和大肠杆菌悬液；(3)将链霉菌孢子悬液和大肠杆菌悬液混合，制备含有安普霉素抗性的接合子；(4)取下接合子在含有卡那霉素、氯霉素和安普霉素的固体MS培养基上传代培养，得到构建海洋来源放线菌基因遗传操作体系。实现了向海洋放线菌MUSC 135导入外源DNA片段的可能性，并明显提高了接合转移效率。为后续对此类菌株的研究奠定基础。

技术领域

本发明属于生物基因工程以及分子生物学技术领域，特别是涉及一种海洋来源放线菌基因遗传操作体系的构建方法。

背景技术

微生物具有多样性及丰富的可利用资源性，是地球上最早出现的生命形式，其生命活动影响着地球的理化性质。其中，海洋微生物有巨大多样性，除了作为海洋生态系统的重要组成发挥作用外，其生境、基因多样性还为我们研究生命进化提供基础。如今，海洋微生物与人类应对的多种问题均有关系，例如渔业过度开发、全球变暖和环境污染问题等。通过对海洋微生物及其他生物相互作用的研究，可以解决环境治理、节能减排、人类健康等问题。

放线菌是高G+C含量的革兰氏阳性菌，广泛存在于海洋沉积物中。海洋放线菌可分泌丰富的次级代谢产物及生物活性物质。有研究表明，来自不同生长环境、不同海域的海洋放线菌会有不同的生物学特性，更可能产生特殊代谢产物。这些产物经发酵被证实据有抗菌、抗肿瘤及特殊的酶活性。

迄今从放线菌中发现的抗生素已有2万种以上，其结构复杂。这些生物质都是由不同的基因簇合成的。放线菌基因组中，次生物质合成基因簇往往呈线性分布，通过复杂的代谢途径网络连接组成。其中，链霉菌属(Streptomyces)是物质合成功能基因最具多样性的放线菌属。在微生物体内，抗生素合成基因和耐药基因是相伴而生的。如果微生物产生某种抗生素，而它没有该抗生素的耐药基因，那么它所产生的该种抗生素就有可能把自己杀灭。若放线菌有某个抗生素的耐药基因，通常说明其具有产生这种抗生素的合成基因。

大量实验结果表明，海洋微生物是极具开发价值的。我们可以通过基础的分子生物学技术探究放线菌的代谢机制，更可以结合全基因组测序及分析方法进一步挖掘生物合成基因簇信息，为发现有开发价值的新化合物奠定基础。然而，目前尚未有海洋来源放线菌基因遗传操作体系及构建方法的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种海洋来源放线菌基因遗传操作体系。

本发明的第二个目的是提供一种海洋来源放线菌基因遗传操作体系的构建方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种海洋来源放线菌基因遗传操作体系的构建方法，包括如下步骤：

(1)将人工质粒pSET152通过化学转化法导入大肠杆菌ET12567(pUZ8002)感受态细胞中，得到供体菌株大肠杆菌ET12567(pUZ8002/pSET152)，所述人工质粒pSET152携带安普霉素抗性基因aac(3)-IV及作为启动子的接合转移位点oriT片段；

(2)将链霉菌MUSC 135接种在MS固体培养基中，35-37℃，培养5-7d后，在长满链霉菌MUSC 135孢子的平板上加无菌水，用接种环刮下孢子倒入离心管中，涡旋振荡打散孢子后离心去除上清液，然后将菌体悬浮于2×YT液体培养基中，配置成浓度为10⁶-10⁸CFU/ml的链霉菌孢子悬液；