[发明专利]一种海洋来源放线菌基因遗传操作体系及构建方法

权利要求书

1.一种海洋来源放线菌基因遗传操作体系的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将人工质粒pSET152通过化学转化法导入大肠杆菌ET12567(pUZ8002)感受态细胞中，得到供体菌株大肠杆菌ET12567(pUZ8002/pSET152)，所述人工质粒pSET152携带安普霉素抗性基因aac(3)-IV及作为启动子的接合转移位点oriT片段；

(2)将链霉菌MUSC 135接种在MS固体培养基中，35-37℃，培养5-7d后，在长满链霉菌MUSC 135孢子的平板上加无菌水，用接种环刮下孢子倒入离心管中，涡旋振荡打散孢子后离心去除上清液，然后将菌体悬浮于2×YT液体培养基中，配置成浓度为10⁶-10⁸CFU/ml的链霉菌孢子悬液；

将所述大肠杆菌ET12567(pUZ8002/pSET152)接种在2×YT固体培养基中，28-30℃，培养1-2d，挑取新鲜单菌落，接种于5ml含有小于等于15.625μg/ml卡那霉素和小于等于15.625μg/ml萘啶酮酸的2×YT液体培养基中，培养1d后离心收集菌体，加入无菌水制成浓度为10³-10⁴CFU/ml大肠杆菌悬液；

(3)按体积比1：1的比例，将所述链霉菌孢子悬液和大肠杆菌悬液混合，均匀涂布于含有10mmol/L MgCl₂的MS固体培养基上；35℃培养20h，用终浓度分别为0、3.2μg/ml、6.4μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml的安普霉素和终浓度为25μg/ml的萘啶酮酸水溶液覆盖整个平板，洗去存在干扰的大肠杆菌，35℃继续培养7d后得到含有安普霉素抗性的接合子；

(4)取下所述接合子在含有浓度为小于等于31.25μg/ml卡那霉素、小于等于7.813μg/ml氯霉素和40-50μg/ml的安普霉素的固体MS培养基上培养4-5d为1代；进行4-5代传代培养，得到海洋来源放线菌基因遗传操作体系。

2.权利要求1的方法构建的海洋来源放线菌基因遗传操作体系。