[发明专利]一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法

说明书

本发明属于农业生物技术领域，本发明提供了一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法。本发明技术方案利用RPA技术，以携带Rickettsia的烟粉虱为材料，提取基因组DNA，并以此为模板，通过反应条件优化、特异性及灵敏度检测等试验，建立一种高效、便捷、省时、特异性好、灵敏度较高的检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的方法，为田间快速检测提供了技术支持，并为烟粉虱与Rickettsia的互作机制研究奠定了基础。

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法。

背景技术

烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)是重要的世界性农业害虫之一，被冠以“超级害虫”的称谓，被列为最危险的100种入侵物种。烟粉虱不仅通过直接刺吸汁液为害寄主植物，而且分泌蜜露导致霉污病滋生而影响植物的光合作用和呼吸作用，更重要是烟粉虱作为病毒的超级载体，能够传播极具破坏性的植物病毒病，每年造成数十亿美元的经济损失。烟粉虱是一个物种复合体，至少包含36个隐种，其中MEAM1隐种(B型)和MED(Q型)是两种入侵性烟粉虱，成为田间为害的优势种。

Rickettsia属于变形菌纲Proteobacteria的α亚群立克次体科Rickettsiaceae革兰氏阴性菌。Rickettsia于1909年在研究洛基山斑疹热时首次发现，通常将Rickettsia分为感染脊椎动物的致病菌和感染节肢动物的共生菌。Rickettsia作为烟粉虱体内重要的次生共生菌，可通过垂直和水平的方式在烟粉虱种群传播。研究表明，Rickettsia对烟粉虱的生殖、发育、抗药性等都有重要影响，且在不同种群和隐种间的感染率不同。

目前对Rickettsia的检测主要依赖于16S或23SrRNA的PCR扩增和测序，但受引物和灵敏度限制而易出现假阴性，且测序验证较耗时。实时荧光定量PCR被广泛用于Rickettsia滴度的检测，虽然其灵敏度更高，但是操作步骤繁琐且耗时耗力。此外，对Rickettsia的检测方法还包括荧光原位杂交(FISH)、16SrDNA扩增子测序等，然而FISH设备昂贵，操作困难，而16SrDNA扩增子测序侧重于微生物群落多样性研究。综上所述，目前对烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测存在假阴性、操作繁琐、设备昂贵、耗时耗力等不足，因此急需一种快速高效检测烟粉虱体内Rickettsia的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法，利用RPA技术，以携带Rickettsia的烟粉虱的基因组DNA为模板，通过反应条件优化、特异性及灵敏度检测等试验建立的检测方法，从而实现快速、准确地检测烟粉虱体内Rickettsia的目的，同时缩减了鉴定时间，节约了生化试剂，降低了成本，为烟粉虱体内共生菌Rickettsia的快速、高效检测提供技术保障。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测引物组，所述引物组包括引物Ric-RPAF和引物Ric-RPAR，所述引物Ric-RPAF的序列如SEQ ID NO.2所示，所述引物Ric-RPAR的序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测试剂盒，包括上述的检测引物组。

本发明还提供了一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法，包括如下步骤：

(1)提取所述烟粉虱基因组DNA；

(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，采用上面所述的引物组进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；