[发明专利]基于单分子测序的融合基因检测的方法

说明书

本发明公开了基于单分子测序的融合基因检测的方法，包括步骤1：对样本进行核酸提取，步骤2：设计单分子的探针，在每个exon连接处往左右各延伸一条探针，若exon长度大于1000dp，则在该exon中间增加一条探针，步骤3：使用探针对核酸进行RNA反转录，得到转录组，步骤4：构建单分子文库，步骤5：对转录组进行靶向富集和捕获，步骤6：对进行靶向富集和捕获后的转录组进行上机测序，步骤7：收集测序数据，得到单分子的reads，进行分析，得出结论，一个单分子能够完整的跨越基因融合断点，使用单分子测序解决了转录本重组装困难的问题，使用kmer计算融合断点，减少了计算量，增加了计算精度，进行靶向捕获，可提高低频基因融合的检出率，减少检测成本和时间。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及基于单分子测序的融合基因检测的方法。

背景技术

现代医学的不断发展，诊断肿瘤的方法学从传统的影像学，扩展到现在的分子诊断，从而实现肿瘤的早发现，早治疗。在肿瘤的发生发展过程中，除了基因突变，还存在基因融合现象，这种基因融合常发生在白血病，乳腺癌，肺癌等常见肿瘤中。因此，检测是否有基因融合的发生，对于肿瘤患者是否需要服用靶向药物，能否延长生存期具有重要的意义。

目前常见的基因融合检测分子病理检测方法包括：荧光原位杂交(FISH)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、免疫组织化学(IHC)、二代测序技术(NGS)等，但由于基因融合具有频率低，组装定位困难等问题，导致融合基因的检测存在转录本重组装困难、计算量大和检出率低的问题。

发明内容

为解决上述背景技术中提出的问题，本发明提供基于单分子测序的融合基因检测的方法，以解决现有检测方法中检测时间长，计算量大和检测率低的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

基于单分子测序的融合基因检测的方法，包括：

步骤1：对样本进行核酸提取；

步骤2：设计单分子的探针，在每个exon连接处往左右各延伸一条探针，若exon长度大于1000dp，则在该exon中间增加一条探针；

步骤3：使用探针对核酸进行RNA反转录，得到转录组；

步骤4：构建单分子文库；

步骤5：对转录组进行靶向富集和捕获；

步骤6：对进行靶向富集和捕获后的转录组进行上机测序；

步骤7：收集步骤6上机测序后产出的数据，得到单分子的reads，进行分析，得出结论。

优选地，步骤4中，构建单分子文库的方法为：加入4种游离的核苷酸，所述4种游离的核苷酸为ATP、TTP、GTP和CTP，加入DNA聚合酶，在DNA聚合酶的作用下4种游离的核苷酸为转录组填补缺口，用PCR对转录组进行扩增，此时的PCR扩增产物即为单分子文库。

优选地，步骤7中的分析过程包括：

S7.1：对单分子的reads进行质控，取出低质量的reads；

S7.2：将单分子的reads与转录组的单分子文库进行对比；

S7.3：寻找并记录断点；

S7.4：没有比对到单分子文库上的，使用kmer算法寻找融合基因和断点；

S7.5：汇总S7.3和S7.4的结果，得出计算出基因融合概率。

优选地，S7.4中的kmer算法包括：

S1：将单分子的reads按照100bp的kmer进行滑窗比对；