[发明专利]一种新型透明质酸酶编码基因及其高产工程菌、构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种新型透明质酸酶编码基因hylP，所述基因hylP来源于链霉菌菌株StreptomycesindicusCGMCC4.5727，其基因序列为SEQ ID NO.1，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明新型链霉菌透明质酸酶编码基因hylP，该基因与已知的透明质酸酶基因同源性低(低于50％)，编码的透明质酸酶具有优异的透明质酸(HA)降解功能。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是一种新型透明质酸酶编码基因及其高产工程菌、构建方法与应用。

背景技术

透明质酸酶是一类具催化透明质酸(Hualuronic Acid,HA)降解功能的酶。在医药(药物扩散剂)、医疗美容(HA填充物降解)、化妆品(制备小分子量透明质酸)及制革等领域具有广泛的应用。根据来源的不同，透明质酸酶分为哺乳动物透明质酸酶、动物毒液透明质酸酶和微生物透明质酸酶三种类别。其中微生物来源的透明质酸酶不受来源限制，而且微生物已有成熟的异源表达模式，表达的酶提取容易，可高度纯化，因此微生物透明质酸酶，以及使用微生物异源表达来生产透明质酸酶更加具有市场潜力。已发现多种微生物可以产生透明质酸酶，但是目前仍存在酶活性相对较低、产量少、安全性未知、降解产物复杂及不明确等问题，限制了微生物来源透明质酸酶的工业化应用。因此，对于新型高效的微生物透明质酸酶市场仍具有迫切需求。

来源于链霉菌的透明质酸酶与动物来源的透明质酸酶相比具有热稳定性、蛋白酶抗性、pH宽泛性、底物特异性和高活性等特点。与其它细菌来源的透明质酸酶相比，链霉菌透明质酸酶一般以随机的内切作用模式作用于HA并产生不同大小的不饱和HA产物(包括HA二糖、HA四糖和六糖等)，而其他来源的一些透明质酸酶作用于β-1,3糖苷键或者β-1,4糖苷键，降解得到的终产物主要是四糖。

在透明质酸酶重组酶的研究中，酵母菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌都可用于重组透明质酸酶的宿主。并且目前已经实现了水蛭透明质酸酶、人透明质酸酶和链霉菌等透明质酸酶的重组表达。专利公开文献CN102439144B和CN 105473607A中公开了一种来源于链霉菌的透明质酸酶，该透明质酸酶来源于链霉菌koganeiensis(Streptomyceskoganeiensis,ATCC31392)，分子量为21.6kDa，等电点(pI)在4.4-4.8之间，在大肠杆菌中的重组表达达到了87000U/ml。且该透明质酸酶在水溶液中高度稳定，对蛋白水解酶类亦不敏感，HPLC纯度高于98％，这些均为治疗用所必需之特性，因此，该酶可单独使用或与其他活性成分联用，以制备人用或兽用药物组合物，用于降解器官或组织中的透明质酸，以达到治疗某些疾病的需要。相比于迄今为止已知的其他透明质酸酶，来源于链霉菌koganeiensis (Streptomyces koganeiensis,ATCC31392)的透明质酸酶已被证实能够水解存在于间质基质中的透明质酸，增加结缔组织的可渗透性并促进皮下局部给药药物以极度稳定性向周围组织的扩散和分散，而没有被存在于该结缔组织中的蛋白水解酶消化的可能性。

来源于链霉菌koganeiensis(Streptomyces koganeiensis,ATCC31392)的透明质酸酶是唯一商业化的链霉菌透明质酸酶，但是其在链霉菌中表达产量低。koganeiensis链霉菌透明质酸酶尽管已在在大肠杆菌中获得成功的异源表达。但是如下原因仍使得生产成本居高不下：

大肠杆菌双层膜结构使得目标分泌蛋白仍累积在周质空间，分离纯化需要细胞收集、破碎等工序；另外外膜中含有脂多糖LPS内毒素，进一步增加了下游分离提取的成本。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术上存在的问题，提供一种新型透明质酸酶编码基因及其高产工程菌、构建方法与应用。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：