[发明专利]一种新型透明质酸酶编码基因及其高产工程菌、构建方法与应用

权利要求书

1.一种新型透明质酸酶编码基因hylP，其特征在于：所述基因hylP来源于链霉菌菌株Streptomyces indicus CGMCC 4.5727，其基因序列为SEQ ID NO.1，其氨基酸序列为SEQID NO.2。

2.如权利要求1所述的基因hylP编码的透明质酸酶。

3.根据权利要求2所述的透明质酸酶，其特征在于：所述透明质酸酶具有28.25kDa的分子量，属于透明质酸裂解酶类(Hyaluronate Lyase，EC 4.2.2.1)。

4.一种高产透明质酸酶的链霉菌工程菌株，其特征在于：所述工程菌株应用了链霉菌高拷贝载体pKC1139载体，应用了gapdh启动子驱动透明质酸酶编码基因hylP的表达，采用xlnc信号肽控制成熟透明质酸酶的分泌，以及采用变铅青链霉菌(Streptomyces lividansTK24)clpP2基因敲除突变株(S.lividans clpP2KO)作为底盘细胞。

5.根据权利要求4所述的高产透明质酸酶的链霉菌工程菌株，其特征在于：所述gapdh启动子来自于迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子，其核苷酸序列为SEQ ID NO.5；所述xlnc信号肽来自于S.lividans中的木聚糖酶C(xylanase C)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.6。

6.如权利要求4或5所述的高产透明质酸酶的链霉菌工程菌株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

a.重组质粒的构建及异源表达；

b.分泌信号肽优化；

c.宿主细胞改造。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤1，蛋白酶基因clpP2突变株(S.lividans clpP2KO)的构建：该菌株在模式菌株S.lividans TK24中对蛋白质量控制系统clpP2基因进行了敲除而获得；

步骤2，构建透明质酸酶高表达质粒：以Streptomyces indicus CGMCC 4.5727基因组为模板，通过PCR反应分别扩增hylP基因及gapdh启动子、xlnc信号肽，通过golden gate连接克隆到pUC质粒载体获得中间质粒pUC57::Pgapdh-SPxlnc-hylP；最后通过限制性内切酶和T4 DNA连接酶将完整的表达元件Pgapdh-SPxlnc-hylP克隆到pKC1139载体，构建成透明质酸酶表达质粒pKC1139::Pgapdh-SPxlnc-hylP；

步骤3，高产透明质酸酶链霉菌工程菌株的获得：将步骤2高表达质粒pKC1139::Pgapdh-SPxlnc-hylP转入至S.lividans clpP2KO菌株，即获得高产透明质酸酶的基因工程菌。

8.如权利要求4或5所述的链霉菌工程菌株在生产透明质酸酶方面中的应用。

9.利用如权利要求4或5所述的链霉菌工程菌株发酵生产透明质酸酶的方法，其特征在于：包括如下步骤：

将链霉菌工程菌株接种到种子培养基中，28℃,200rpm发酵培养，种子液发酵48h后，以2％的接种量转接发酵培养基中进行发酵4天，取发酵上清液，得到透明质酸酶；

其中，种子培养基TSB的配方为：酪蛋白胨：17g/L，大豆蛋白胨:3g/L,NaCl：5g/L,K2HPO4：2.5g/L，葡萄糖：2.5g/L；

发酵培养基TSB的配方为：酪蛋白胨：17g/L,大豆蛋白胨:3g/L,NaCl：5g/L,K2HP O4:2.5g/L,葡萄糖：2.5g/L。

10.利用如权利要求4或5所述的链霉菌工程菌株制备不同分子量透明质酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：

将链霉菌工程菌株接种到种子培养基中，28℃,200rpm发酵培养，种子液发酵48h后，以2％的接种量转接发酵培养基中进行发酵4天，取发酵上清液进行HA的酶切处理；

稀释发酵液至不同透明质酸酶浓度即酶活力分别为40U/ml、20U/ml、10U/ml、8U/m l、4U/ml，酶切处理条件：每1ml不同浓度的透明质酸酶与10ml 15g/L的透明质酸混合，37℃200rpm摇床处理1h，获得不同分子量的透明质酸；

其中，种子培养基TSB的配方为：酪蛋白胨：17g/L，大豆蛋白胨:3g/L,NaCl：5g/L,K2HPO4：2.5g/L，葡萄糖：2.5g/L；

发酵培养基TSB的配方为：酪蛋白胨：17g/L,大豆蛋白胨:3g/L,NaCl：5g/L,K2HPO4:2.5g/L,葡萄糖：2.5g/L。