[发明专利]一种大体积培养的CAR NK细胞的收获方法

说明书

本申请涉及免疫细胞治疗技术领域，具体涉及一种大体积培养的CAR NK细胞的收获方法。收获方法包括：将大体积培养的CAR NK细胞培养物进行连续流离心，得到浓缩后的细胞；连续流离心的离心力为700～900g，转速为200～280rpm；将浓缩后的细胞置换于新鲜培养基中，进行辐照处理，得到辐照后的细胞。本申请方法能够达到细胞治疗产品生产制备阶段全自动和全封闭的要求，且单批次生产规模较大，病人使用的成本显著降低，并且不同批次间差异小，产品质量更可控。

技术领域

本申请涉及免疫细胞治疗技术领域，具体涉及一种大体积培养的CAR NK细胞的收获方法。

背景技术

传统的肿瘤治疗方式主要包括手术、放化疗以及以小分子抑制剂和治疗性抗体为代表的靶向治疗策略。相比于化疗以及放疗，靶向治疗由于毒副作用小，生物相容性高，对于某些类型的肿瘤具有积极的治疗结果，逐渐成为目前肿瘤治疗的主流技术手段。但是，靶向治疗还存在很多缺点，一方面同一种药物不一定对同一类型的癌症患者均有效，需要进一步挖掘和分析患者的亚群分类信息以及基因型的分型情况，同时靶向治疗还存在多次给药后肿瘤耐药和癌症复发转移的问题。

近年来大量科学研究和临床实践表明，机体免疫系统在预防和抑制恶性肿瘤的发生和发展过程中具有重要作用。通过增强机体免疫系统的功能来进行肿瘤的预防和治疗，是肿瘤治疗领域最热门的治疗手段。肿瘤免疫治疗主要是通过系统性地激发和增强患者免疫系统的功能从而实现对肿瘤细胞的杀伤和清除作用。大量的临床实践表明，肿瘤免疫治疗比手术、化疗、放疗以及靶向治疗等传统的肿瘤治疗方式具有更显著的治疗效果，同时具有安全性更高，毒副作用更低的特点。

自然杀伤细胞(Nature killer cell,NK)源于骨髓中的造血前体细胞，广泛分布于不同的组织，如外周血，脾脏，肺，肝脏等。正常人外周血中NK细胞占淋巴细胞的5％～10％，在脐血中占免疫细胞的10％～20％。大量的科学研究已经证实了NK细胞在癌症免疫中的作用及治疗潜力，同时许多证据也揭示了实体瘤及血液恶性肿瘤的发生与NK细胞的功能受损有关。

当NK细胞被激活后，即可在趋化因子的作用扩散并浸润至感染部位和肿瘤病灶，发挥对恶性转化细胞的杀伤作用。同时，激活后的NK细胞还能够分泌多种细胞因子和趋化因子，如IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、IMP-3、CCL5等，这些细胞因子和趋化因子能够招募并活化树突状细胞、单核-巨噬细胞等免疫呈递细胞，引导NK细胞与内皮细胞或其他免疫细胞相互作用，发挥连接天然免疫和适应性免疫的桥梁作用。基于NK细胞的肿瘤免疫治疗手段是目前除T细胞外另一种重要的肿瘤治疗策略。与T细胞治疗方法相比，NK细胞对肿瘤细胞的杀伤和清除无“MHC限制性”，不会发生严重的“细胞因子风暴”，无移植物抗宿主病(GVHD)的反应，是最有前景开发成可规模化生产制备的“货架型”肿瘤免疫细胞治疗产品的细胞类型。与CAR T细胞类似，通过对NK细胞进行嵌合抗原受体修饰，能够发挥NK细胞靶向识别和杀伤表达特定肿瘤抗原的肿瘤细胞，同时发挥免疫调节的作用。

随着过继性CAR NK细胞疗法在肿瘤治疗中得到重视，CAR NK细胞产品的下游收获和制备工艺也越来越受到人们的关注。目前，CAR NK细胞产品下游制备方法主要还采用与CAR T细胞产品类似的技术路线，绝大部分还停留在“手动”加“敞口”操作的方式，生产制备过程操作复杂，过度依赖人工操作，产品质量不稳定性较高，批次间差异大。其次，因为CART到目前为止还是一种“个体化”的细胞治疗产品，细胞培养规模小，培养体积大概仅1-2L左右，一个病人仅制备1-2袋细胞(One Batch-一批次)，不能满足CAR NK细胞治疗产品同种异体的临床使用需求，限制了肿瘤免疫细胞疗法在生物医学领域的大规模推广和临床应用。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种大体积培养的CAR NK细胞的收获方法。该方法能够达到细胞治疗产品生产制备阶段全自动和全封闭的要求，单批次生产规模较大，病人使用的成本显著降低，并且不同批次间差异小，产品质量更可控。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：