[发明专利]一种口腔鳞癌颈部淋巴结转移灶类器官的培养基及构建方法

说明书

本发明涉及类器官领域，公开了一种口腔鳞癌颈部淋巴结转移灶类器官的培养基及构建方法。该方法包括：在消化液中，将肿瘤组织消化，得到消化组织悬液，将所述消化组织悬液进行细胞过滤离心，保留沉淀，得到细胞沉淀；利用缓冲液重悬所述细胞沉淀，统计活细胞数；根据统计的活细胞数，将类器官接种至孔板中,加入培养基，将孔板静置于培养箱中进行培养；培养3天后，类器官培养体系中肿瘤浸润淋巴细胞只剩余5％活性细胞，将类器官消化后，终止消化，离心。本发明解决了在类器官培养中淋巴细胞对类器官形成抑制作用，影响肿瘤类器官构建成功率的问题。

技术领域

本发明涉及类器官领域，尤其涉及一种口腔鳞癌颈部淋巴结转移灶类器官的培养基及构建方法。

背景技术

口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)是口腔颌面部常见的恶性肿瘤。大规模测序数据已经揭示口腔鳞癌遗传学变异集中于抑癌基因，原癌基因的突变频率极低，可作为有效的治疗靶点极少。以测序数据指导临床用药与患者实际药效仍存在直接有效证据，迫切需要新的治疗手段为患者提供个体化治疗方案。

类器官(organoid)是一种将具有干性潜能的细胞进行3D培养的体外细胞模型，类器官能够自发模拟体内器官的微观结构和功能，其基因组特征与体内原发肿瘤相似性约90％，而且能够保持病人原发肿瘤内肿瘤细胞的异质性，肿瘤类器官模型是当前临床前广泛应用的药物敏感性筛选和验证模型。然而由于口腔内处于有菌污染环境，这是口腔癌类器官构建成功率较低的主要因素之一。

口腔癌颈淋巴结转移是口腔癌最为常见的症状之一，颈淋巴结转移也是口腔癌预后主要危险因素之一，口腔癌颈淋巴结转移灶较口腔癌原发灶癌细胞的侵袭性和干性更强，更适于类器官的培养。对于相当一部分早期口腔癌患者(T1和T2期)，其最开始的手术常常采取单纯的原发灶的扩大切除，然而仍有30％左右这类患者术后常常出现颈淋巴结转移，对于转移的这部分患者，通过构建其淋巴结转移灶的类器官为后续药敏检测提供术后辅助用药依据，存在非常广阔的应用场景。同时，仍需提及的是，大约有5％头颈部淋巴结转移灶患者其原发灶不明，这一类患者的后续治疗也只能依靠转移淋巴结的相关信息制定后续的治疗方案。颈淋巴结处于无菌环境，避免口腔癌原发灶类器官构建过程中污染的不利因素。因此构建口腔癌淋巴结转移灶的类器官，为患者个体化用药提供依据，有着非常广阔的应用需求。但口腔鳞癌颈转淋巴结中含有大量淋巴细胞，在类器官培养中淋巴细胞对类器官形成起到抑制作用，影响肿瘤类器官构建成功率。

发明内容

本发明的主要目的在于解决现有技术因淋巴细胞的存在无法有效构建出口腔鳞癌淋巴结转移灶类器官模型的问题。

本发明第一方面提供了一种构建口腔鳞癌淋巴结转移灶类器官模型的培养基。所述培养基在Advanced DMEM/F12基础培养基下加入以下重量百分比的物质：

1-2％的Hepes缓冲液、1-2％的青霉素链霉素溶液、1-2％的Glutamax、2-3％的B27、1-2％的N2、5-10mmol/L的烟酰胺、10-20ng/mL的NRG1、1 -2mmol/L的N-乙酰半胱氨酸、10-20uM的Y-27632、100-120ng/ml的Noggin、100-120ng/ml的R-spondin1、500-550nmol/L的A83-01、100-120ng/ml的EGF、50-60ng/ml的FGF10、100-120ng/ml的FGF2、10-15uM的Forskolin。

本发明还提供了一种构建口腔鳞癌淋巴结转移灶类器官模型的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：

在消化液中，将肿瘤组织消化，得到消化组织悬液，

将所述消化组织悬液进行细胞过滤离心，保留沉淀，得到细胞沉淀；

利用缓冲液重悬所述细胞沉淀，统计活细胞数；

根据统计的活细胞数，将类器官接种至孔板中，加入培养基，将孔板静置于培养箱中进行培养；