[发明专利]一种基于ERA技术的虾偷死野田村病毒快速可视化检测方法及检测用引物和探针

说明书

本发明提出了一种基于ERA技术的虾偷死野田村病毒快速可视化检测方法及检测用引物和探针，本发明提供基于ERA技术的虾偷死野田村病毒检测用引物和探针，基于ERA技术的虾偷死野田村病毒快速可视化检测方法，本发明采用的虾偷死野田村病毒的ERA检测方法，摆脱了PCR过程中对热循环仪的依赖，实验操作步骤简单，耗时短速度快，检测灵敏度高，且结果可视化。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种基于ERA技术的虾偷死野田村病毒快速可视化检测方法及检测用引物和探针。

背景技术

偷死野田村病毒病是一种严重危害养殖虾类的病毒性疾病，目前我国主要对虾养殖地区均有该病流行。其病原为偷死野田村病毒(Covert mortality nodavirus,CMNV)，属于野田村病毒科、甲型野田村病毒属。病毒颗粒呈球形，大小为25～30纳米，核酸类型为RNA。CMNV可感染虾卵、幼体、仔虾、稚体和成虾等。该病多发生于较高水温(28℃以上)、虾累计死亡率可达80％。该病毒可通过亲虾的精、卵细胞进行垂直传播。病虾游泳足肌肉因病毒感染而受损，游泳能力下降。病虾通常在池底深水区陆续死亡，不容易被养殖者观察到。病虾表现出肝胰腺萎缩、颜色变浅、甲壳变软、空肠空胃、生长缓慢等症状，很多时候还可见病虾腹节肌肉不透明或局部发白。

目前，对于对虾是否感染偷死野田村病毒的检验通常采用病理学电镜观察、细胞培养、酶联免疫吸附实验(Elisa)和聚合酶链反应(PCR)检测等。其中电镜观察与细胞培养对仪器设备与操作技术有较高要求。目前国内外已有很多利用ELISA方法检测偷死野田村病毒的报道，该方法灵敏度高，操作简单，但抗体制备的周期与检测的时间较长，费用较高，且灵敏度不及RT-PCR，但每个RT-PCR反应全部流程需要2个小时左右才出结果，在快速现场检测中发挥的作用有限。酶促重组等温扩增技术(Enzymatic RecombinaseAmplification，ERA)是中国苏州先达基因科技有限公司开发出的等温扩增技术，具有快速简便、操作简单、结果可靠的优点。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于提出一种基于ERA技术的虾偷死野田村病毒快速可视化检测方法及检测用引物和探针。

ERA是一种新的核酸扩增方法，该技术主要依赖于3种酶：能结合单链寡核苷酸引物的重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶。其中，重组酶与引物结合形成重组酶-引物复合物，在DNA单链结合蛋白的协助下，对相对应互补位点进行置换与结合反应，使目的DNA呈指数式扩增。这种新方法使用等温DNA扩增技术，具有高度特异性、敏感性、稳定性、快速性，并且可以在常温度完成反应。其反应速度快，在20min内可以达到指数式的增长。目前ERA技术已广泛应用于细菌、真菌、病毒、癌症的分子诊断。本发明即采用ERA技术进行虾偷死野田村病毒的快速检测，该发明技术在对虾病原体快速检测的实践具有广阔的应用前景和明显的实用价值。

为达成上述目标，本发明所采用的技术方案如下：

本发明提供一种基于ERA技术的虾偷死野田村病毒快速可视化检测用引物和探针，所述引物包括如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物，如SEQ IDNO.2所示核苷酸序列的下游引物，所述探针依序包括如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示核苷酸序列的探针，所述探针SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的3’端标记荧光报告基团，探针SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的5’端标记荧光猝灭基团，所述荧光报告基团和荧光猝灭基团通过四氢呋喃连接。

进一步的，所述四氢呋喃的连接位点为自探针SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的5’端至少30nt，自探针SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的3’端至少15nt。

进一步的，所述探针SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的自5’端起第26位碱基T标记FAM荧光报告基团，探针SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的自5’端起第1位碱基T标记BHQ1荧光猝灭基团。

进一步的，所述四氢呋喃插入FAM荧光报告基团和BHQ1荧光猝灭基团之间。