[发明专利]一种催化合成L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的环糊精转移酶的高通量筛选方法

说明书

本发明涉及一种催化合成L‑抗坏血酸‑2‑葡萄糖苷的环糊精转移酶的高通量筛选方法，包括如下步骤：在待筛选菌株的培养体系中加入β‑环糊精和抗坏血酸，调节pH至5.0‑6.0进行催化反应；催化反应之后去除菌株，加入氧化剂进行氧化反应；氧化反应之后加入L‑抗坏血酸‑2‑葡萄糖苷的显色剂进行显色。本发明通过预氧化的策略，使未反应的抗坏血酸得以去除，再加入能与L‑抗坏血酸‑2‑葡萄糖苷显色的物质，在一定条件下进行反应，并且反应后可以方便地在酶标仪进行检测，从而准确定量反应液体系中L‑抗坏血酸‑2‑葡萄糖苷的含量，为高通量筛选突变菌株带来便利。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种催化合成L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的环糊精转移酶的高通量筛选方法。

背景技术

目前L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷(AA-2G)合成中，世界领先的是日本企业“株式会社林原”，使用的酶为CGTase，即“环糊精转移酶”，该酶在工业上大规模用于β-环糊精的合成。为了提高催化合成AA-2G的效率，有必要筛选具有更高活性的环糊精转移酶。对于该酶的筛选，通常使用的方法有“酚酞变色圈法”及“甲基橙法”。其基于的原理在于通过细菌产生CGTase酶把淀粉转化成环糊精，利用环糊精包裹酚酞或甲基橙，使溶液褪色，来达到评价酶活性的目的。很显然，这种方式并非直接评价AA-2G的合成活性，不能真实体现利用该酶来合成AA-2G的水平。

因此，如何获得一种直接评价环糊精转移酶催化合成AA-2G的活性的方法，将其应用于高通量筛选，用于从饱和突变库中快速、准确地得到有益的突变菌株是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于一种基于直接评价环糊精转移酶催化合成L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷活性的高通量筛选方法。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：

本发明一方面涉及一种催化合成L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的环糊精转移酶的高通量筛选方法，包括如下步骤：

在待筛选菌株的培养体系中加入β-环糊精和抗坏血酸，调节pH至5.0-6.0进行催化反应；

催化反应之后去除菌株，加入氧化剂进行氧化反应；

氧化反应之后加入L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的显色剂进行显色。

本发明通过氧化反应，使得未反应的抗坏血酸被氧化，而L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷在此过程中未受到破坏，通过L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的显色剂进行显色从而可以定量的检测出L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的含量。

在本发明的一个优选实施方式中，所述β-环糊精和抗坏血酸的添加重量比为1：1-2。

本发明的一个优选实施方式中，所述氧化剂为过氧化氢、臭氧、Fe³⁺盐和空气或氧气的组合中的一种或者多种的组合；优选地，所述氧化剂为过氧化氢，采用过氧化氢作为氧化剂，其氧化还原产物对于反应体系的影响更小。

在本发明的一个优选实施方式中，所述显色剂为磷钼酸，加热到70-90℃进行显色。AA-2G在显色过程中被分解成抗坏血酸及葡萄糖，从而使磷钼酸显蓝绿色，并且由于体系已经不存在游离状态的抗坏血酸，因此对该显色过程不造成影响；而且，经过验证葡萄糖本身不会对反应体系造成干扰。

在本发明的一个优选实施方式中，所述显色反应之后通过酶标仪检测吸光度，通过吸光度数据定量确定L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的含量。

本发明通过预氧化的策略，使未反应的抗坏血酸得以去除，再加入能与AA-2G显色的物质，在一定条件下进行反应，并且反应后可以方便地在酶标仪进行检测，从而准确定量反应液体系中AA-2G的含量，为高通量筛选突变菌株带来便利。

附图说明

图1为0小时样品谱图；

图2为反应2.0小时后样品谱图；