[发明专利]一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法和应用

说明书

本发明提出了一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法和应用，其中提取方法包括如下步骤：S1，取水稻成熟种子，经消毒处理后，培养至孕穗分化期；S2，取培育好的水稻，并将水稻茎节切成0.5‑1mm长度，用D‑山梨醇溶液浸泡10‑20min；S3，取浸泡好的茎节加入到酶解液中进行酶解，酶解时间为3‑5h；S4，向酶解液中加入等体积原生质体释放液，轻摇释放原生质体；S5，将酶解液和原生质体释放液的混合液过滤，离心分离，得到原生质体。提取与现有技术相比，本发明的提取方法具有提取活率高，碎片率和结团率低的优点，为后续进行单细胞测序实验提供了充足的材料。

技术领域

本发明涉及植物原生质体提取技术领域，尤其涉及一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法和应用。

背景技术

单细胞转录组测序技术能够在单细胞分辨率下研究样本的转录组信息，可以完美解决细胞异质问题，能全面真实揭示细胞多样性和复杂性，在细胞类型、复杂细胞生物学进程解析、癌症和疾病发生机制探索等方面发挥重要作用。近年来，单细胞测序在植物上的应用也逐渐推广，植物单细胞转录组测序从不同层面对细胞发育、细胞功能及基因网络调控等方向进行深入研究探索，打开了我们对植物细胞真实的微观世界认知的大门。

植物细胞外面有一层坚硬的细胞壁，起着保护和支撑作用。植物细胞壁不易破坏分解，植物组织需要通过酶解消化掉细胞外面的一层细胞壁，解离成原生质体才能开展单细胞测序。由于植物中各种组织类型细胞壁的组成不同，破壁所需要的酶类型及浓度和其他反应条件不同，需要采用有针对性的原生质体制备方法。

专利号为CN113621552A、CN113046291A和CN114058564A的发明专利公开了紫花苜蓿根部细胞、亚洲棉根尖细胞、艾草叶片组织的原生质体提取方法，虽然水稻与紫花苜蓿、棉花、艾草同属于植物，但是由于生存于不同的环境中，植物通常表现出截然不同的生长发育特性，造成了水稻茎细胞与紫花苜蓿根部细胞、亚洲棉根尖细胞、艾草叶片组织细胞在生理生化、结构、功能等方面均具有非常大的差异，适用于紫花苜蓿根部细胞、亚洲棉根尖细胞、艾草叶片组织原生质体提取的方法在水稻茎细胞中不能有效发挥功能，亟需开发一种适用于水稻茎组织原生质体的提取方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种适用于水稻茎组织原生质体的提取方法和应用。

本发明的技术方案是这样实现的：第一，本发明提供了一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法，包括如下步骤：

S1，水稻培养

取水稻成熟种子，经消毒处理后，培养至孕穗分化期；

S2，水稻茎预处理

取培育好的水稻，并将水稻茎节切成0.5-1mm长度，用D-山梨醇溶液浸泡10-20min；

S3，酶解

取浸泡好的茎节加入到酶解液中进行酶解，酶解时间为3-5h；所述酶解液包括纤维素酶RS、离析酶R-10、蜗牛酶、D-山梨醇、MES、KCl、CaCl₂和BSA；

S4，原生质体释放

向酶解液中加入等体积原生质体释放液，轻摇释放原生质体；

S5，分离

将酶解液和原生质体释放液的混合液过滤，离心分离，得到原生质体。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述酶解液的配方为：1％-3％纤维素酶RS、0.5％-2％离析酶R-10、0.5％-1％蜗牛酶、80-95g/L D-山梨醇、20-30mmol/L MES、10-20mmol/L KCl、10-20mmol/L CaCl₂、0.1％-0.5％BSA，溶剂为去离子水，pH为5-6；所述酶解液使用前需要采用孔径为0.2-0.3μm的混合纤维素滤膜过滤除菌。