[发明专利]一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法和应用

权利要求书

1.一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1，水稻培养

取水稻成熟种子，经消毒处理后，培养至孕穗分化期；

S2，水稻茎预处理

取培育好的水稻，并将水稻茎节切成0.5-1mm长度，用D-山梨醇溶液浸泡10-20min；

S3，酶解

取浸泡好的茎节加入到酶解液中进行酶解，酶解时间为3-5h；所述酶解液包括纤维素酶RS、离析酶R-10、蜗牛酶、D-山梨醇、MES、KCl、CaCl₂和BSA；

S4，原生质体释放

向酶解液中加入等体积原生质体释放液，轻摇释放原生质体；

S5，分离

将酶解液和原生质体释放液的混合液过滤，离心分离，得到原生质体。

2.如权利要求1所述的一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法，其特征在于：所述酶解液的配方为：1％-3％纤维素酶RS、0.5％-2％离析酶R-10、0.5％-1％蜗牛酶、80-95g/LD-山梨醇、20-30mmol/LMES、10-20mmol/LKCl、10-20mmol/LCaCl₂、0.1％-0.5％BSA，溶剂为去离子水，pH为5-6；所述酶解液使用前需要采用孔径为0.2-0.3μm的混合纤维素滤膜过滤除菌。

3.如权利要求1所述的一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法，其特征在于：酶解时需在25-28℃避光条件下，以50-70rpm/min转速酶解2-5h。

4.如权利要求1所述的一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法，其特征在于：步骤S5的离心分离方法为：利用孔径为70μm的细胞过滤器过滤混合液，去掉残余组织后，将上清液置于离心管中，利用300g离心力在4℃下离心5min，弃上清液后，经过2次原生质体释放液重悬和离心后，再重悬，然后置于冰上30min，利用孔径为40μm的细胞过滤器过滤，再次离心去掉上清液。

5.如权利要求4所述的一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法，其特征在于：步骤S5离心分离后用含有D-山梨醇的W1溶液2次重悬细胞和离心，清洗Ca²⁺，然后再次重悬即可获得原生质体。

6.如权利要求4所述的一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法，其特征在于：所述原生质体释放液的配方为：80-95g/LD-山梨醇、20-25mmol/LMgCl₂、4-6mmol/LMES和0.1％-0.3％BSA，溶剂为去离子水，pH为5-6。

7.如权利要求5所述的一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法，其特征在于：所述W1溶液的配方为80-95g/LD-山梨醇、3-5mmol/LMES和15-25mmol/LKCl，溶剂为去离子水，pH为5-6。

8.如权利要求1所述的一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法，其特征在于：水稻茎节选取水稻第一剑叶位置的茎节。

9.如权利要求1-8任一项所述的提取方法所提取的原生质体。

10.如权利要求9所述的原生质体在单细胞转录组测序中的应用。