[发明专利]SerA和/或FliZ在调控杆菌霉素L产量中的应用以及构建的基因工程菌

说明书

本发明公开了SerA和/或FliZ在调控杆菌霉素L产量中的应用以及构建的基因工程菌，本发明通过敲除或者失活贝莱斯芽孢杆菌中SerA和/或FliZ编码基因提高贝莱斯芽孢杆菌杆菌霉素L产量，其中基因工程菌以贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314为出发菌株，敲除或者失活菌株基因组中负调控SerA和/或FliZ基因所得。本发明的基因工程菌株发酵生产杆菌霉素L的产量是菌株CPLK1314的12倍，在5L发酵罐优化培养基中48h可稳定生产杆菌霉素L，产量达到3.67g/L。该杆菌霉素L高产基因工程菌及其构建方法为加速杆菌霉素L的产业化提供原材料。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种SerA和/或FliZ在调控杆菌霉素L产量中的应用以及构建的基因工程菌。

背景技术

杆菌霉素L(Bacillomycin L)是一种由七个氨基酸残基(L-Asp-D-Tyr-D-Asn-L-Ser-L-Gln-D-Ser-L-Thr)的多肽链和14-17个β-氨基脂肪酸链连接组成的两亲性脂肽类化合物，与Iturin A、C、D、E，Bacillomycin D、F、Lc和Mycosubtilin同属于“Iturin”家族。杆菌霉素L对大部分酵母和霉菌有良好的抗真菌活性，也具有较好溶血活性。除此之外，杆菌霉素L能通过降解真菌细胞膜上的磷脂，改变细胞膜的通透性使真菌失去活性死亡。鉴于杆菌霉素L在农业生产、医药及环境治理等领域具有广泛的应用前景，但是贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314在微生物发酵工艺下生产杆菌霉素L的产量较低，选育能高效生产杆菌霉素L的微生物资源具有重要的价值。

杆菌霉素L以非线性核糖体途径合成，其基因簇全长约39kb，含有4个开放阅读框架，分别编码Bac D、Bac A、Bac B和Bac C四种多功能复合酶以催化完成合成过程。杆菌霉素L具有较强的抗真菌活性，是一种具有良好应用前景的抗微生物制剂。然而，野生菌株中低产量的特性限制了其进一步应用。申请人前期研究显示杆菌霉素L在贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314中的产量极低，这是限制其应用的最大瓶颈。因此，挖掘与杆菌霉素L合成相关的调控基因，阐明其合成途径，可以为提高其产量奠定基础，再结合同源重组等技术手段构建高产工程菌，这对促进其开发应用具有重要意义。

发明内容

发明目的：针对目前现有菌株生产杆菌霉素L的产量甚少，限制其广泛的运用，本发明提供SerA和/或FliZ在调控杆菌霉素L产量中的应用，本发明通过对以贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314基因组中负调控基因SerA及FliZ基因进行敲除或者缺失构建得到了全新的高产杆菌霉素L的基因工程菌。

本发明还提供所述高产杆菌霉素L的基因工程菌及其构建方法和应用。

技术方案：为了实现上述目的，本发明所述SerA和/或FliZ编码基因在调控贝莱斯芽孢杆菌杆菌霉素L产量中的应用。

其中，通过敲除或者失活贝莱斯芽孢杆菌中SerA和/或FliZ编码基因提高贝莱斯芽孢杆菌杆菌霉素L产量。

本发明所述一种高产杆菌霉素L的基因工程菌，所述基因工程菌以贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314为出发菌株，敲除或者失活菌株基因组中负调控基因SerA和/或FliZ所得。

其中，所述负调控基因SerA，FliZ的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。

其中，所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314。

本发明所述高产杆菌霉素L的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)以SerA，FliZ编码基因为模板设计引物，以贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314的基因组DNA作为模板，扩增到部分SerA，FliZ基因片段；

(2)同源重组质粒载体pMUTINSerA的构建：扩增的SerA基因片段经过双酶切，然后连接到经过同样双酶切的质粒载体pMUTINLoc中，构建同源重组整合质粒载体pMUTINSerA；