[发明专利]SerA和/或FliZ在调控杆菌霉素L产量中的应用以及构建的基因工程菌

权利要求书

1.SerA和/或FliZ编码基因在调控贝莱斯芽孢杆菌杆菌霉素L产量中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过敲除或者失活贝莱斯芽孢杆菌中SerA和/或FliZ编码基因提高贝莱斯芽孢杆菌杆菌霉素L产量。

3.一种高产杆菌霉素L的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以贝莱斯芽孢杆菌为出发菌株，敲除或者失活菌株基因组中负调控基因SerA和/或FliZ所得。

4.根据权利要求3所述的高产杆菌霉素L的基因工程菌，其特征在于，所述负调控基因SerA，FliZ的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求1所述的高产杆菌霉素L的基因工程菌，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌优选为贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314。

6.一种权利要求1所述高产杆菌霉素L的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以SerA，FliZ编码基因为模板设计引物，以贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314的基因组DNA作为模板，扩增到部分SerA，FliZ基因片段；

(2)同源重组质粒载体pMUTINSerA的构建：扩增的SerA基因片段经过双酶切，然后连接到经过同样双酶切的质粒载体pMUTINLoc中，构建同源重组整合质粒载体pMUTINSerA；

(3)同源重组质粒载体pUCSCFliZ的构建：扩增的FliZ基因片段经过双酶切，然后连接到经过同样双酶切的质粒载体pUCSCSrf中，构建同源重组整合质粒载体pUCSCFliZ；

(4)SerA基因失活突变菌株ΔSerA的构建：将构建好的重组质粒pMUTINSerA转化至贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314得到高产杆菌霉素L的SerA基因失活突变株ΔSerA；

(5)FliZ基因失活突变菌株ΔFliZ的构建：将构建好的重组质粒pUCSCFliZ转化至贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314得到高产杆菌霉素L的FliZ基因失活突变株ΔFliZ；

(6)SerA与FliZ双基因失活突变菌株ΔSerA+FliZ的构建：将构建好的重组质粒pMUTINSerA转化至贝莱斯芽孢杆菌CPLK1314突变株ΔFliZ中得到高产杆菌霉素L的SerA与FliZ双基因失活突变菌株ΔSerA+FliZ。

7.根据权利要求6的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述的引物为SerA-F(5′-TTTAAGCTTCTCAGATAAGATGAGCAATG-3′)和SerA-R(5′-TTTGGATCCTTCCACTTCAAACACGTCAA-3′)用于扩增SerA基因片段；FliZ-F(5’-TTTGGATCCTCTGCATCTTCTGTCTCCGC-3’)和FliZ-R(5’-TTTAAGCTTCTGATATCGCATAAGCGGG-3’)用于扩增FliZ基因片段。

8.一种权利要求3所述高产杆菌霉素L的基因工程菌在发酵生产杆菌霉素L中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述发酵为通过基因工程菌进行发酵罐发酵：将菌种活化后制备种子液，按照体积比10-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在6.8-7.2，温度维持在35-38℃，溶氧在25-35％之间；发酵周期40-50h。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基组成为：蔗糖20g/L，麦芽糖浆40-50g/L，玉米浆15-20g/L，尿素0.6-0.8g/L，K₂HPO₄7g/L，MgSO₄·7H₂O 0.35g/L，FeSO₄·7H₂O 10mg/L，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，MnSO₄·H₂O 0.05g/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1-3mg/L，pH 7.0-7.2。