[发明专利]构建氧化应激防御系统得到的高产生育酚的重组裂殖壶菌、其构建方法与应用

说明书

本发明提供一种高产生育酚的重组裂殖壶菌，所述重组裂殖壶菌表达过氧化物酶POD、谷胱甘肽还原酶GSR、硫氧还蛋白还原酶TRXR和/或葡萄糖6‑磷酸脱氢酶G6PD基因中的一种或多种基因。本发明通过加强了裂殖壶菌的细胞氧化应激防御途径和醛解毒途径来提高生育酚合成前体物质的合成，同时表达抗氧化酶、ROS清除酶和醛清除酶达到降低生育酚和成过程中活性氧的目的，提高生育酚合成过程中关键基因的表达，有效提高了重组菌的生育酚含量。本发明的重组裂殖壶菌在摇瓶发酵中生育酚总含量为1096.2μg/g DCW，在发酵罐发酵试验中总生育酚含量达到1102.8μg/g DCW，实现了高生育酚产量。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及通过裂殖壶菌中构建氧化应激防御系统得到的能够高产生育酚的重组裂殖壶菌，还涉及所述重组菌的构建方法，及其在生产生育酚中的应用。

技术背景

维生素E又名生育酚，对人体最重要的生理功能是促进生殖，同时也是一种抗氧化剂，具有清除自由基、抗癌、抗心血管疾病、提高免疫力和抗衰老的作用。我国是维生素E生产大国，维生素E合成工艺复杂，技术要求高，越来越多的研究人员使用传统的培养方法和基因工程技术来增加裂殖壶菌的生育酚产量。因此，通过生物技术手段调控一些关键酶基因的表达，成为天然生育酚合成的有效途径。

氧气供应在裂殖壶菌属的细胞增殖和脂质积累中起关键作用。生育酚合成代谢过程中产生的活性氧ROS和活性醛会导致蛋白质、脂质和核酸氧化，从而破坏DNA复制、蛋白质功能丧失，甚至细胞死亡，从而影响裂殖壶菌中生育酚的合成。微生物细胞利用各种解毒酶和非酶防御机制来保护细胞成分免受ROS和反应性醛的侵害。主要的抗氧化酶包括过氧化氢酶CAT、超氧化物歧化酶SOD、抗坏血酸过氧化物酶APX、过氧化物酶POD和谷胱甘肽过氧化物酶GPO。还原型谷胱甘肽GSH和硫氧还蛋白TRX是重要的非酶促小分子，可清除细胞中的ROS。谷胱甘肽还原酶GSR催化NADPH依赖的谷胱甘肽二硫化物GSSG还原为GSH，硫氧还蛋白还原酶TRXR利用NADPH还原TRX的活性位点二硫化物。葡萄糖6-磷酸脱氢酶G6PD在代谢过程中会产生NADPH能保护红细胞免受氧化物质的威胁，同时为还原型谷胱甘肽GSH和硫氧还蛋白TRX的合成提供NADPH。醛脱氢酶ALDH是一种氧化酶，参与外源性和内源性醛的解毒。在用于生产生育酚的微生物发酵过程中，产生的ROS和反应性醛会损害细胞代谢并抑制脂质生产力。因此，控制细胞内氧化物质的水平至关重要。

裂殖壶菌(Schizochytrium)是一类海洋异养微生物，其单细胞内能够积累大量对人体有益的活性物质，这些活性物质合成所用到的共同前体物质乙酰辅酶A在裂殖壶菌中含量比较高，而乙酰辅酶A也是生育酚合成上游过程中的一个关键前体物质，因此期望在已成功构建生育酚合成通路的裂殖壶菌中表达几种抗氧化酶，构建氧化应激防御系统，从而提高裂殖壶菌中生育酚含量。

发明内容

本发明的目的是进一步提高裂殖壶菌中生育酚含量，通过建立氧化应激防御系统提高生育酚的产量，提供一种高产生育酚的重组工程菌株。

基于此，本发明提供一种高产生育酚的重组裂殖壶菌，所述重组裂殖壶菌表达过氧化物酶POD、谷胱甘肽还原酶GSR、硫氧还蛋白还原酶TRXR和/或葡萄糖6-磷酸脱氢酶G6PD基因中的一种或多种基因。

作为一种优选的实施方式，本发明的重组裂殖壶菌还表达过氧化氢酶CAT、超氧化物歧化酶SOD、抗坏血酸过氧化物酶APX、谷胱甘肽过氧化物酶GPO和/或醛脱氢酶ALDH基因中的一种或多种基因。

作为一种特别优选的实施方式，所述重组裂殖壶菌表达过氧化物酶POD、谷胱甘肽还原酶GSR和硫氧还蛋白还原酶TRXR基因。