[发明专利]构建氧化应激防御系统得到的高产生育酚的重组裂殖壶菌、其构建方法与应用

权利要求书

1.高产生育酚的重组裂殖壶菌，其特征在于所述重组裂殖壶菌表达过氧化物酶POD、谷胱甘肽还原酶GSR、硫氧还蛋白还原酶TRXR和/或葡萄糖6-磷酸脱氢酶G6PD基因中的一种或多种基因。

2.根据权利要求1所述的重组裂殖壶菌，其特征在于所述重组裂殖壶菌还表达过氧化氢酶CAT、超氧化物歧化酶SOD、抗坏血酸过氧化物酶APX、谷胱甘肽过氧化物酶GPO和/或醛脱氢酶ALDH基因中的一种或多种基因。

3.根据权利要求1所述的重组裂殖壶菌，其特征在于所述重组裂殖壶菌表达过氧化物酶POD、谷胱甘肽还原酶GSR和硫氧还蛋白还原酶TRXR基因。

4.根据权利要求1-3中任一项权利要求所述的重组裂殖壶菌，其特征在于：CAT的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、SOD的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示、GPO的核苷酸序列如SEQID NO.3所示、GSR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示、TRXR的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示、G6PD的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示、POD的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示、APX的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示、ALDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

5.权利要求1-4中任一项权利要求所述的重组裂殖壶菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)获得目的基因

提取裂殖壶菌ATCC20890基因组，利用PCR技术从裂殖壶菌ATCC20890基因组扩增得到目的基因G6PD；

提取大肠杆菌DH5α基因组，利用PCR技术从DH5α基因组DNA中分别扩增得到目的基因SOD、ALDH、CAT和POD；

提取Y.lipolytica Po1f基因组，利用PCR技术从Y.lipolytica Po1f cDNA中分别扩增得到从目的基因GPO、GSR和TRXR；

人工合成目的基因APX；

(2)构建质粒载体

将步骤(1)获得的目的基因分别与质粒载体pJN44连接，分别得到质粒pJN44-CAT、pJN44-SOD、pJN44-GPO、pJN44-POD、pJN44-TRXR、pJN44-ALDH、pJN44-GSR、pJN44-G6PD和pJN44-APX；

设计带酶切位点引物扩增GSR目的片段，将所得片段连接到pJN44-TRXR上，构建得到质粒pJN44-TRXR-GSR；

设计带酶切位点引物扩增POD目的片段，将所得片段连接到pJN44-TRXR-GSR上，构建得到质粒pJN44-TRXR-GSR-POD；

设计带酶切位点引物扩增G6PD目的片段，将所得片段连接到pJN44-TRXR-GSR-POD上，构建得到质粒pJN44-TRXR-GSR-POD-G6PD；

(3)构建重组裂殖壶菌

按照裂殖壶菌电转化方式将步骤(2)得到的表达质粒分别转化到转化到裂殖壶菌ATCC20890中，得到重组裂殖壶菌ATCC20891-1(CAT)、ATCC20891-2(SOD)、ATCC20891-3(GPO)、ATCC20891-4(POD)、ATCC20891-5(TRXR)、ATCC20891-6(ALDH)、ATCC20891-7(GSR)、ATCC20891-8(G6PD)、ATCC20891-9(APX)、ATCC20891-10(TRXR-GSR)、ATCC20891-11(TRXR-GSR-POD)和ATCC20891-12(TRXR-GSR-POD-G6PD)。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于所述方法还包括步骤(4)：重组裂殖壶菌的筛选

(4.1)通过对各重组裂殖壶菌ROS水平的测定，筛选出能显著降低活性氧水平的重组菌株；

(4.2)通过对各重组裂殖壶菌生育酚合成途径中关键基因的实时荧光定量PCR，筛选出能显著提高其关键基因的表达的重组菌株；

(4.3)通过对各重组裂殖壶菌生育酚含量的测定，筛选出高产生育酚的重组菌株。