[发明专利]一种可调控YIP蛋白过表达的栗酒裂殖酵母基因工程菌的构建方法及其应用

说明书

一种可调控YIP蛋白过表达的栗酒裂殖酵母基因工程菌的构建方法及其应用，一种用探究于小核糖核蛋白复合体的组装机制的模型构建方法，属于生物工程和生物医药领域的应用。本发明公开了一种通过nmt1启动子过表达YIP基因的栗酒裂殖酵母模型的构建方法，可以应用于探究小核糖核蛋白复合体的组装机制，了解YIP在这一过程中的作用，帮助我们理解Gemin2在人体中的作用。

技术领域

本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体而言，涉及调控YIP蛋白过表达的裂殖酵母的构建方法及其应用；通过nmt 1启动子来条件调控YIP蛋白的表达。

背景技术

栗酒裂殖酵母（ Schizosaccharomyces pombe）属于子囊菌亚门、酵母科中的裂殖酵母亚科。比较基因序列发现，栗酒裂殖酵母比酿酒酵母更接近哺乳动物细胞。被广泛用于细胞生物学的研究。是至今细胞分裂的最典型生物模型。酵母领域因研究细胞分裂得到诺贝尔奖的得主 Paul Nurse 发掘了酵母细胞在细胞生物学的优势，并且带领建立的系统的酵母细胞完整基因敲除库。

脊髓性肌萎缩症(SMA)是一种常见的常染色体隐性神经退行性疾病，是婴儿死亡的主要遗传原因之一。SMA的特征是脊髓前角运动神经元变性，导致肌肉无力和萎缩。SMA是由于存活运动神经元蛋白(SMN)的表达水平降低或突变所致。在哺乳动物中，SMN与Gemin2构成异源二聚体在小核糖核蛋白复合体（snRNP）的组装中扮演着重要作用。小核糖核蛋白复合体是真核生物转录过程中的必要元件，其减少和突变均会导致细胞功能的紊乱。YIP作为与Gemin2在裂殖酵母中的同源蛋白，其功能有着高度保守性。我们可以通过控制YIP的表达来探究小核糖核蛋白复合体的组装机制，了解YIP在这一过程中的作用，帮助我们理解Gemin2在人体中的作用。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供出一种可调控YIP蛋白过表达的栗酒裂殖酵母基因工程菌模型的构建方法。

本发明还要解决的技术问题是提供上述栗酒裂殖酵母基因工程菌的应用。

发明思路：YIP作为与Gemin2在裂殖酵母中的同源蛋白，其功能有着高度保守性。因此，通过控制YIP的表达来探究该蛋白在栗酒裂殖酵母的作用。

为解决上述第一个技术问题，本发明公开了上述栗酒裂殖酵母基因工程菌模型的构建方法，包括如下步骤：

(1)提取栗酒裂殖酵母的cDNA与基因组DNA；

(2)以步骤（1）得到的cDNA为模板，扩增得到yip开放阅读框序列组合片段YIP-r，包括上游nmt 1启动子3’同源臂和下游pFA6a-3HA-kanMX6插入位点的3’同源臂；

(3)以步骤（1）得到的基因组DNA为模板，扩增得到nmt 1启动子组合片段nmt1-r，包括上游pFA6a-3HA-kanMX6插入位点的5’同源臂和下游yip开放阅读框序列5’同源臂；

(4)以步骤（2）和（3）得到的片段作为模板，通过overlap PCR扩增得到插入质粒片段nmt1-YIP-r；

(5)把质粒pFA6a-3HA-kanMX6线性化，以pFA6a-3HA-kanMX6和步骤（4）得到的片段为模板，通过Exnase重组酶转入大肠杆菌感受态，待富集扩增后，提取得到目的质粒；

优选地，Exnase重组酶使用方法，包括：

配制重组体系；

加热孵育。

更优选地，配置重组体系的方法，包括：

加入pFA6a-3HA-kanMX6线性化质粒100ng和40ng插入质粒片段nmt1-YIP-r。

更优选地，加热孵育的方法，包括：