[发明专利]一种可调控YIP蛋白过表达的栗酒裂殖酵母基因工程菌的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种可调控YIP蛋白过表达的栗酒裂殖酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取栗酒裂殖酵母的DNA与cDNA；

以步骤（1）得到的DNA、cDNA为模板，得到yip开放阅读框序列组合片段YIP-r与nmt 1启动子组合片段nmt1-r；

以步骤（2）得到的yip开放阅读框序列组合片段YIP-r与nmt 1启动子组合片段nmt1-r为模板，得到插入质粒片段nmt1-YIP-r；

对质粒pFA6a-3HA-kanMX6进行线性化，通过体外重组酶的方式，将步骤（3）得到的nmt1-YIP-r插入质粒得到 pFA6a-3HA-kanMX6-nmt1-YIP；

将步骤（4）得到的pFA6a-3HA-kanMX6-nmt1-YIP转化至非遗传霉素抗性栗酒裂殖酵母感受态中，使用特定的筛选培养基，筛选得到一种可调控YIP蛋白过表达的栗酒裂殖酵母基因工程菌。

2.如权利要求1所述的一种可调控YIP蛋白过表达的栗酒裂殖酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，由nmt1启动子调控YIP编码序列的表达，其中，

nmt1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

YIP编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

它们的组合核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

3.如权利要求1所述的一种可调控YIP蛋白过表达的栗酒裂殖酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，非遗传霉素抗性栗酒裂殖酵母感受态为野生型栗酒裂殖酵母或栗酒裂殖酵母yHL6381。

4.如权利要求1所述的一种可调控YIP蛋白过表达的栗酒裂殖酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，使用的筛选培养基为含有500μg/mL G418的YPDA培养基或EMM2培养基。

5.如权利要求4所述筛选培养基，其特征在于，培养基中没有硫胺素使YIP过表达或添加2μM以上的硫胺素抑制其表达。

6.如权利要求1-4所述的构建方法所得的一种可调控YIP蛋白过表达的栗酒裂殖酵母基因工程菌、权利要求5所述的培养基在YIP过量表达对栗酒裂殖酵母生长影响以及对裂殖酵母中小核糖核蛋白复合体组装机制研究的应用。