[发明专利]用于检测犬冠状病毒的引物探针组合物、试剂盒及方法

说明书

本发明提供的这种以用于检测犬冠状病毒的引物探针组合物作为主要成分的试剂盒耗时短、特异性高、重复性好、灵敏度高，接近现有技术中检测犬冠状病毒的最高水平，该方法特异性强，与犬瘟热病毒、犬腺病毒2型、副流感病毒和犬细小病毒等无交叉反应；敏感性试验结果表明，它的最低检测限为40～50copies/L,高于常规RT‑PCR方法10倍左右。能够对犬冠状病毒进行特异性检测，且设计合成的引物对之间以及引物与其他病毒之间无交叉反应，因此可用于临床犬副流感病毒的快速诊断和流行病学调查。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及用于检测犬冠状病毒的引物探针组合物、试剂盒及方法。

背景技术

犬冠状病毒(canine coronavirus，CCV)属于冠状病毒科冠状病毒属，是一种带囊膜的单链RNA病毒。病犬和带毒犬是本病的主要传染源。经呼吸道、消化道随口涎、鼻液、粪便等排毒，污染饲料、饮水、笼具和周围环境，直接或间接地传给易感动物。所有品种及年龄的犬都易感，还包括犬科的野生动物。CCV感染的发病率约为30％，其发生严重程度常与断乳、运输、气温骤变、饲养条件恶劣等应激因素和年龄及混合感染有关。本病的潜伏期为1～3天。传播迅速，数日内即可蔓延至全群，有的呈水样腹泻，有的无临床症状。目前实验室诊断CCV的方法有：病毒分离鉴定、免疫扩散、免疫荧光、PCR、ELISA、电镜镜检等。其中临床常用的检测方法为RT-PCR。PCR技术因敏感性高、特异性强、费用低等优点已成为一种经典的检测方法，广泛用于犬冠状病毒的检测。

目前针对犬冠状病毒的试剂盒大多存在操作复杂、特异性差、灵敏度低及检测结果准确性不高等缺陷。鉴于此，本发明建立了一种快速检测用于犬冠状病毒的检测方法，为临床检测提供了保障。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中对犬副流感病毒检测操作复杂、特异性差、灵敏度低及检测结果准确性不高的问题。

为此，本发明提供了一种用于检测犬冠状病毒的引物探针组合物，包括：

正向引物，其序列为：5’-GCTTACACATCGTACACTGA-3’；

反向引物，其序列为：5’-CTAACAACCTGCTCATTGGT-3’；

探针，其核酸序列为：5’-GATCTTGGTATGAAGCGTAGTGGTTA-3’。具体地，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

具体地，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas RED或LCRED460中的一种，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2或BHQ3中的一种。

本申请还提供了一种用于检测犬冠状病毒的试剂盒，包括PCR反应液；所述PCR反应液包括任意一项所述的用于检测犬冠状病毒的引物探针组合物。

具体地，所述PCR反应液包括：1-5mM MgCl2，20-50mM Tris，100-500mg/L BSA，10-100uM dNTPs，0.1-1.0uM正向引物，0.1-1.0uM反向引物，0.1uM荧光探针组成。

具体地，所述试剂盒还包括酶混合液；所述酶混合液包括40U/μL的RNA酶、抑制剂、25U/μL的逆转录酶和5U/μL的Taq酶混合组成。

具体地，还包括阳性对照和阴性对照。

具体地，所述阳性对照为临床上收集犬副流感病毒强阳性样本；所述阴性对照为超纯水。

本申请还提供了一种用于检测犬冠状病毒的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样本的DNA；

(2)以待测样本的DNA为模板，进行荧光定量PCR反应，所述PCR反应体系包括权利要求1-3任意一项所述的用于检测犬冠状病毒的引物探针组合物；