[发明专利]一种温郁金及其醋制品质量评价方法

权利要求书

1.一种温郁金及其醋制品的质量评价方法，其特征在于，步骤为：结合血清药物化学和谱效关联追踪温郁金及其醋制品入血成分并靶向其质量标志物：

(1)温郁金及其醋制品提取物制备

取温郁金及其醋制品饮片，用15倍量的90％乙醇加热回流，分2次提取，每次1.5h；双层纱布过滤，药渣加10倍量的水，加热回流1.5h，合并以上提取液，50℃减压浓缩至0.2g·ml^-1，得到生、醋温郁金提取物，用于成分定性分析和后期大鼠灌胃；

(2)动物模型构建，给药与样本收集

复制大鼠肝郁气滞痛经模型后，腹腔注射3％戊巴比妥钠(1ml·kg^-1)麻醉；腹主动脉取血，室温静置1h，3 000r·min^-1离心20min，取上清即得血清，用于后续血清成分定性分析实验；同时，迅速取新鲜大鼠子宫、肝脏组织，生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分，称重；子宫和肝脏部分组织-80℃冰箱冷冻保存，用于后续ELISA和RT-qPCR实验；

(3)温郁金及其醋制品治疗肝郁气滞痛经的药效评价

扭体反应：于末次给药后腹腔注射缩宫素，观察0.5h内的扭体反应，记录扭体潜伏期和扭体次数；

ELISA实验：按照试剂盒说明书严格进行，测定子宫组织中PGF2α、PGE2、β-EP、Ca²⁺水平的含量，以及血清中5-HT水平的含量；

RT-qPCR实验：按试剂盒说明书提取细胞总RNA，按逆转录试剂盒说明书进行逆转录，根据文献报道设计特异性引物，以β-actin为内参基因，配制相应反应体系，进行定量；

(4)血清的供试品溶液制备

精密吸取血清样品200μl，加入1000μl甲醇，涡旋1min，充分沉淀蛋白，离心，取上清液1000μl置2.0ml离心管，于真空离心浓缩机中挥干溶剂(30℃)，加入200μl甲醇复溶，涡旋5min，离心，取上清液200μl，即得；同时，从各样品中分别吸取10μl混合后制备质量控制(QC)样本，去蛋白等步骤同前；

(5)基于UPLC-Q-TOF-MS/MS分析含药血清的成分

①色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18(2.1mm×100mm,1.8μm)；流动相为0.1％甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～5min，5％～45％B；5～10min，45％～55％B；10～12min，55％～70％B；12～25min，70％～100％B；25～27min，100％B；27～29min，100％～5％B；29～31min，5％B)，流速0.3ml·min-1，柱温35℃，进样量1μl；

②质谱条件

采用ESI离子源，正、负离子模式全波长扫描；质谱检测器参数设置如下：离子喷雾电压5.5kV/-4.5kV，离子源温度550℃，解簇电压60V，碰撞能量35eV；辅助气体为N₂，气帘气35psi，Gas155 psi，Gas255 psi；采用MS/MS二级质谱模式扫描，质量数扫描范围100～2000m/z；质谱数扫描范围100～1500m/z；动态背景扣除。数据采集通过TF 1.6软件获得；

③UPLC-Q-TOF-MS/MS分析

取上述(4)中血液供试品溶液，在上述色谱/质谱条件下，通过UPLC-Q-TOF-MS/MS进行检测，通过分子量、结构式、特征碎片离子等多种信息匹配，表征其入血成分及代谢产物；

(6)入血成分与药效学指标相关性分析

采用SPSS统计软件对入血成分和药效指标两个变量进行spearman相关分析。相关系数r处于-1至1之间，当0.5|r|0.8时，表明两变量是中度相关；|r|0.8时，表明两变量是高度相关；

(7)质量标志物的鉴定

生、醋温郁金提取物的供试品溶液制备：精密吸取(1)提取液1.5ml，4℃，离心，取上清液1.2ml，用SPE柱洗脱样品，取续滤液，稀释，离心，取上清液，过滤膜，即得；

在(5)色谱/质谱条件下，通过分析质谱数据，通过UPLC-Q-TOF-MS/MS进行检测，并将分子离子峰和离子片段信息与参考文献或数据库进行比较，共表征了32个入血质量标志物群：zederone，curcolonol，zedoalactone A，zedoalactone C，turmerone，β-elemenone，curcumalactone，姜黄醇酮，郁金二酮，4-表-莪术醇，异原莪述烯醇，亚油酸，呋喃二烯，γ-榄香烯，δ-榄香烯，β-瑟林烯，α-律草烯，β-石竹烯，橙黄胡椒酰胺乙酸酯，莪术烯醇，原莪术烯醇，13-羟基吉马酮，(4S,5S)-(+)-吉马酮4,5-环氧化物，异莪术烯醇，吉马酮，β-榄香烯，邻苯二甲酸二异丁酯，莪术双环烯酮，莪术醇，莪术二酮，新莪术二酮和(4S)-二氢莪术双环烯酮。