[发明专利]一种用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的方法

说明书

本发明公开了一种用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的方法，属于分子生物学技术领域。本发明首次提出了灰茶尺蠖VGSC基因C3037T突变是灰茶尺蠖对联苯菊酯产生抗药性的分子标记，建立了快速检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗性的分子标记方法。本发明特异性引物分别位于两个外显子区域，既可用于检测DNA模板，又可用于检测RNA模板。本发明所述标记的特异性强，稳定性高，可以快速区分灰茶尺蠖田间种群是否存在C3037T突变及该位点突变是否纯合，为灰茶尺蠖对拟除虫菊酯类的田间抗性提供一种快速的分子检测手段，同时为茶园合理使用杀虫剂提供科学依据。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的方法。

背景技术

灰茶尺蠖隶属于鳞翅目尺蛾科，该虫适生区范围广，在我国各主要茶区均有分布。由于其食性强、繁殖速度快，经常在局部茶园暴发成灾，对茶叶产量、品质和茶园生态造成严重影响，也是茶园中主要的食叶性害虫。目前，化学防治是该害虫的主要防治方法。我国有效期内茶园用农药，联苯菊酯为登记数量最高的有效成分。联苯菊酯是一类新型拟除虫菊酯类农用杀虫剂品种，具有击倒作用强、广谱、高效、快速、长残效等特点，以触杀作用和胃毒作用为主，无内吸作用。由于该类药剂对鳞翅目害虫具有较强的杀虫活性，且多且对哺乳动物和非目标动物安全，因而在多个农业国家和地区的灰茶尺蠖防治中得到了广泛的应用。

在茶园害虫防治过程中合理选择农药产品并减量使用是非常必要的。同时，由于长期、大量不合理使用农药，导致昆虫产生严重的抗药性，进一步增加了该虫防治难度。因此，监测灰茶尺蠖的抗药性情况，并对灰茶尺蠖制定耐药性管理，指导茶园科学合理使用杀虫剂，对于控制茶园灰茶尺蠖暴发至关重要。然而，目前灰茶尺蠖抗药性检测一般采用传统的杀虫剂毒力测定方法。该法需要在田间采集大量的昆虫样品并在室内饲养后方可进行，该方法实施难度大、不易操作且所需周期长。因此，开发灵敏可靠的分子检测进行抗药性诊断是十分必要的。

联苯菊酯主要作用于昆虫的神经系统，通过延长电压门控钠离子通道基因(voltage gated sodium channel gene，VGSC)的开放，使靶标害虫兴奋、痉挛、麻痹而死亡。有研究报道，VGSC基因中许多位点存在单核苷酸多态性(SNP)，这些位点的非同义突变与拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性的直接关系。目前还未有灰茶尺蠖VGSC基因抗性突变报道。

随着分子生物技术的发展及其广发应用，分子标记已被广泛使用，该方法也适用于抗性突变位点检测。找到灰茶尺蠖对联苯菊酯抗性的分子标记，对于监测茶园灰茶尺蠖抗性水平和茶园害虫防治具有重要科学意义和应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与联苯菊酯杀虫剂抗性相关的灰茶尺蠖分子标记。本发明的目的还在于提供用于扩增上述分子标记的引物，以及利用该引物检测上述分子标记的方法。

本发明中可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供了灰茶尺蠖(Ectropis grisescens Warren)VGSC基因C3037T突变作为分子标记在灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性检测中的应用。

本发明还提供了用于检测灰茶尺蠖VGSC基因C3037T突变的试剂在制备灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性检测的试剂盒中的应用。

一种与联苯菊酯杀虫剂抗性相关的灰茶尺蠖分子标记，该分子标记位点位于如SEQ ID NO.1所示灰茶尺蠖电压门控钠离子通道基因cDNA序列的第3037位，该分子标记位点存在C→T突变，氨基酸由亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F)，位于如SEQ ID NO.2所示灰茶尺蠖电压门控钠离子通道基因氨基酸序列的第1013位。

本发明还提供了一种用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的引物对，包括上游引物和下游引物，序列为：

上游引物：5’-ATTATGTGGACCGATTCCCTGAC-3’；