[发明专利]一种用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的方法

权利要求书

1.灰茶尺蠖(Ectropis grisescens Warren)VGSC基因C3037T突变作为分子标记在灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性检测中的应用。

2.用于检测灰茶尺蠖VGSC基因C3037T突变的试剂在制备灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性检测的试剂盒中的应用。

3.一种用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的引物对，其特征在于，包括上游引物和下游引物，序列为：

上游引物：5’-ATTATGTGGACCGATTCCCTGAC-3’；

下游引物：5’-TTTACCAATATCTATGAGCAAGC-3’。

4.一种用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述引物对。

5.一种用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取灰茶尺蠖DNA或RNA模板，

(2)以步骤(1)所得灰茶尺蠖DNA或RNA模板作为PCR扩增模板，使用权利要求3所述引物对进行PCR扩增，

(3)将步骤(2)PCR扩增产物进行测序，如果其中对应于灰茶尺蠖VGSC基因3037位的核苷酸序列为C，则为野生型；如果其中对应于灰茶尺蠖VGSC基因3037位的核苷酸序列为T，则为耐药型；如果其中对应于灰茶尺蠖VGSC基因3037位的核苷酸序列包含C和T两种，则为杂合型。

6.如权利要求5所述用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的方法，其特征在于，步骤(1)中提取灰茶尺蠖DNA的方法包括：

先将采集的灰茶尺蠖消毒和清洗，与裂解液混合研磨至灰茶尺蠖组织研磨充分；65℃金属浴消化60min。随后沸水浴10min使裂解液中的蛋白酶K失活；12000rpm离心1min，所获得的上清液即为灰茶尺蠖DNA；

所述裂解液组成为：10mmol/L Tirs，pH 8.4；50mmol/L KCl，0.45％Tween-20，0.2％Gelatin，0.45％NP 40，60μg/mL蛋白酶K。

7.如权利要求5所述用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增体系为20μl，包括：Kod Mix 10μl，待测DNA模板20ng，10μM正反向引物各0.8μl，ddH₂O补足至20μl。

8.如权利要求5所述用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增程序为：预变性95℃1min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃延伸3min。

9.如权利要求5所述用于检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR产物克隆与测序分析方法具体包括以下步骤：

S1.对PCR产物进行纯化，得到纯化产物；

S2.将S1步骤中得到的纯化产物连接至载体pCE2 TA/Blunt-Zerovector，得到连接产物；

S3.将S2步骤中得到的连接产物通过热激法转化到感受态细胞中，得到转化细胞；

S4.将S3步骤中得到的转化细胞扩大培养，得到菌液；

S5.筛选阳性菌液克隆进行测序，并进行核苷酸突变分析。

10.一种用于检测灰茶尺蠖种群对联苯菊酯抗性是敏感种群还是抗性种群的方法，其特征在于，对一定区域内的灰茶尺蠖采样，各样品分别使用权利要求5所述方法检测灰茶尺蠖对联苯菊酯抗药性，根据检测结果计算该区域内灰茶尺蠖VGSC基因C3037T突变的频率，突变频率越高且纯合突变越高表示该区域内灰茶尺蠖对联苯菊酯抗性越强。