[发明专利]利用RNA环化技术制备寡肽的方法及寡肽的表达DNA

说明书

本发明公开了一种利用RNA环化技术制备寡肽的方法，其特征在于其步骤包括：(1)构建寡肽的表达DNA，该表达DNA包括自环化序列1‑起始密码子‑串联重复的寡肽编码DNA‑RBS序列‑自环化序列2；(2)将构建的寡肽的表达DNA构建到表达载体上，转入宿主细胞中进行表达，得到融合寡肽；(3)纯化融合寡肽；(4)使用蛋白酶切割分离；(5)纯化分离后的寡肽。还公开了相应的寡肽的表达DNA及表达载体和宿主。本发明将寡肽通过重复进行串联，串联后的编码框ORF不包含终止密码子。当mRNA被自环化序列进行环化后，环化的ORF不含有终止密码子，因此可以持续地进行滚环式翻译，最终产生含有很多重复串联序列的融合蛋白。

技术领域

本发明涉及一种利用RNA环化技术制备寡肽的方法及寡肽的表达DNA，属于蛋白表达技术领域。

背景技术

寡肽又称为小肽、低聚肽或称为小分子活性肽，2～10个氨基酸彼此缩合形成的化合物，是多肽的一种分类。在20世纪60年代出Newey和Smyth(1959,1960)第一次提供了肽被完整吸收的资料。蛋白质在小肠中被消化成氨基酸与寡肽，且寡肽可以完整的进入肠粘膜细胞并水解成氨基酸进入血液循环。寡肽具有不需要消化直接吸收、吸收时不消耗能量、不增加肠胃功能负担、100％被人体吸收等特点。

传统的寡肽合成主要分为化学合成和生物合成。化学合成利用固相或者液相介质，将肽链依照顺序逐个添加到合成中间产物上。这种化学合成的方法适用于二肽或者三肽的合成，但是对于长一点的寡肽的合成，就会出现反应步骤多，副产物和中间产物多，产量低和提纯困难等问题。生物合成是利用生物系统的蛋白表达技术，将寡肽融合蛋白表达在宿主内部，再经过蛋白纯化和寡肽释放来获得目的寡肽。这种方法的优势是不受寡肽长度和氨基酸序列的影响，可以简单高效地合成寡肽，副产物少，也是目前工业上合成寡肽的重要方法。但这种方法对较短的寡肽难以应用，较短的寡肽如二肽或者三肽在融合蛋白中的占比极少，通过融合蛋白的表达方式往往获得的寡肽产量很低，难以应用于大规模生产。环状RNA是一个共价闭合环状的RNA分子，具有稳定性好、翻译效率高和免疫原性低等特点，成为基因表达、核酸药物和疫苗的重要载体工具。但是其是否可以用于寡肽的表达和纯化，目前还不得而知。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用RNA环化技术制备寡肽的方法，生产成本低、流程简单、易规模化。

本发明采用的技术方案为：

一种利用RNA环化技术制备寡肽的方法，其步骤包括：

(1)构建寡肽的表达DNA，该表达DNA包括自环化序列1-起始密码子-串联重复的寡肽编码DNA-RBS序列-自环化序列2；

(2)将上述构建的寡肽的表达DNA构建到表达载体上，转入宿主细胞中进行表达，得到融合寡肽；

(3)表达后的融合寡肽进行纯化；

(4)纯化后的融合寡肽使用蛋白酶切割分离；

(5)纯化分离后的寡肽。

优选的，所述表达DNA包括自环化序列1-起始密码子-亲和标签/分泌标签/自聚集标签-串联重复的寡肽编码DNA-RBS序列-自环化序列2。

优选的，所述自环化序列1的序列如SEQ ID No.1所示，所述自环化序列2的序列如SEQ ID No.2所示。

优选的，所述寡肽指2-50个氨基酸的小分子肽。

优选的，所述寡肽为二肽-1、二肽-2、AP二肽、三肽-1、三肽-5、三肽-8、谷胱甘肽、四肽-5、四肽-7、四肽-9、四肽-11、五肽-4、六肽-2、六肽-3、六肽-8、六肽-9、九肽-1、十肽-4、蓝铜肽、律波肽或胶原蛋白肽。

优选的，所述蛋白酶选择切割位点为寡肽的最后一个氨基酸的蛋白酶，用于将融合寡肽切割分离成单独的寡肽。