[发明专利]7α-羟基类固醇脱氢酶突变体及其在7-氧代-石胆酸合成中的应用

说明书

本发明公开了7α‑羟基类固醇脱氢酶突变体及其在7‑氧代‑石胆酸合成中的应用，属于基因工程和生物催化技术领域。本发明通过将Brucella melitensis 7α‑羟基类固醇脱氢酶(Bm7α‑HSDH)口袋特定的氨基酸实施定点突变，并组合了部分优势突变，获得了热稳定性和催化效率均得到显著提升的突变体。在催化底物鹅去氧胆酸合成7‑氧代‑石胆酸的反应中，突变体酶活力最多提高约45倍，催化效率提高约122倍，T_m值最大可提升约12℃，为生物法催化合成熊去氧胆酸提供了优质的生物酶和前体化合物，为实现其工业化生产奠定了坚实的研究基础。

技术领域

本发明涉及7α-羟基类固醇脱氢酶突变体及其在7-氧代-石胆酸合成中的应用，属于基因工程和生物催化技术领域。

背景技术

鹅去氧胆酸(3α,7α-二羟基-5-β-胆烷酸)是一种含有2个羟基的类固醇，主要作用是降低胆汁内胆固醇的饱和度。7-氧代-石胆酸(3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸)是鹅去氧胆酸的还原产物，充当熊去氧胆酸(3α,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸)合成的中间体。熊去氧胆酸与鹅去氧胆酸互为立体异构体，主要作用是治疗治疗胆结石、脂肪肝、胆汁性消化不良和预防新冠病毒等。

7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH，EC 1.1.1.159)是用于生产7-氧代-石胆酸的主要酶之一。7α-羟基类固醇脱氢酶属于短链脱氢酶/还原酶，包含Rossmann折叠的NAD(P)H/NAD(P)⁺结合域和一个由Ser-Tyr-Lys组成的活性催化三联体。目前已经克隆了10种不同来源的7α-HSDH基因并进行了功能验证。这些7α-HSDH的氨基酸序列同源性为17.57％–73.93％，在7-氧代-石胆酸生产中显示出不同的催化效率和热稳定性。但天然的7α-HSDH酶在7-氧代-石胆酸生产中热稳定性较差和效率低。据报道，来自Xanthomonas maltophilia的7α-HSDH在反应24h后，7-氧代-石胆酸的产率仅有80％。来自Clostridium absonum的7α-HSDH在37℃孵育2h后，其残余活性低于50％。

发明人筛选到一种来自Brucella melitensis的7α-HSDH，能够以鹅去氧胆酸为底物，催化合成7-氧代-石胆酸，但是野生型酶稳定性和催化效率较低，导致生物制备过程中消耗较高的时间成本和经济成本。因此提高7α-HSDH的热稳定性和催化效率，可以为该酶催化合成熊去氧胆酸的中间体7-氧代-石胆酸的工业化生产奠定坚实的研究基础。

发明内容

本发明人团队发现来自B.melitensis的7α-HSDH，能够以鹅去氧胆酸为底物，催化合成7-氧代-石胆酸，但是野生型酶稳定性和催化效率较低，导致生物制备过程中需要较高的时间成本和经济成本。

本发明将来源于B.melitensis的7α-HSDH基因根据大肠杆菌密码子的偏好性进行密码子优化并人工合成其基因，命名为Bm7α-HSDH；然后通过对特定的氨基酸进行突变，获得了催化效率与热稳定性提高的7α-HSDH突变体，可用于实现7-氧代-石胆酸的高效合成。

本发明的来源于B.melitensis的7α-HSDH基因含有915bp碱基，本发明提供了针对大肠杆菌密码子偏好性进行优化得到的基因7α-HSDH，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1所示基因编码的7α-HSDH包含有305个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了一种7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶的第262位、第301位、第258位中的一个或多个氨基酸突变后得到的。

本发明提供了一种7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列的第262位赖氨酸突变为苏氨酸得到的，命名为：K262T；