[发明专利]基于碳点金纳米酶的α-鹅膏毒肽检测方法

说明书

本发明公开了基于碳点金纳米酶的α‑鹅膏毒肽检测方法，该方法是利用葡萄糖碳点和柠檬酸钠为还原剂及稳定剂制备碳点金纳米酶，该碳点金纳米酶具有较强的拟过氧化物纳米酶特性，能氧化底物TMB为蓝色o‑TMB，α‑鹅膏毒肽特异性结合在纳米酶上覆盖了纳米酶上的活性位点，使纳米酶催化活性下降，利用α‑鹅膏毒肽标准溶液对碳点金纳米酶进行特异性、灵敏度及实际样品的加标回收检测，均表明该碳点金纳米酶检测法具有操作简单、灵敏度高的特点，能实现α‑鹅膏毒肽的可视化检测，检测在20分钟内完成，可在后续应用在对实际样品中的α‑鹅膏毒肽含量进行检测。

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种碳点金纳米酶的制备及基于碳点金纳米酶建立的α-鹅膏毒肽检测方法。

背景技术

蘑菇中毒是一个对人类健康造成威胁的全球性问题。研究发现，蘑菇中毒90%的死亡是由含鹅膏毒肽类蘑菇引起。α-鹅膏毒肽是鹅膏毒肽中含量最高的致死毒素，对人的致死剂量约为0.1mg/kg；误食含鹅膏毒肽的野生菌后，鹅膏毒肽将进入肝细胞并与 RNA 聚合酶Ⅱ结合，抑制 mRNA 的转录和蛋白质合成，最终导致肝细胞坏死。鹅膏毒肽中毒目前尚未发现特效解毒剂，文献报道多粘菌素 B 可以竞争与 RNA 聚合酶Ⅱ的结合位点，从而抑制α-鹅膏毒肽与 RNA 聚合酶Ⅱ的结合；动物实验表明，多粘菌素 B 可显著降低小鼠体内 α-鹅膏毒肽诱导的肝肾损伤，但目前为止尚未有进一步的临床实验报道。根据毒理学研究，鹅膏毒素从血清中迅速消失，但在摄入后4天内可在尿液中检测到。由于尿液样本相对容易获得，且尿液中鹅膏毒肽的检测持续时间较血清长，因此尿液似乎是进行快速鹅膏毒肽分析的一个明显的样本基质。近年来出现了较多检测α-鹅膏毒肽的检测方法。例如，仪器分析法具有特异性强、灵敏度高的特点，但是该方法需要昂贵的仪器设备和复杂的样品前处理。

金纳米粒子（AuNPs）是纳米技术中使用最多的材料之一，具有固有的多功能性，包括催化性能和酶类活性。但类酶AuNPs受到活性低和稳定性差的限制，导致应用受阻，需要更多努力来提高类酶活性。碳点（CDs）具有良好的还原能力，是合成AuNPs的绿色还原剂。一些研究小组已经证明，CDs/金属纳米复合材料显示出更强的催化活性，通过使用基于碳点的AuNPs，克服了活性低和稳定性差的限制。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明利用金纳米（AuNPs）固有的催化和模拟酶特性来检测α-鹅膏毒肽，本发明方法是采用葡萄糖碳点、柠檬酸钠为还原剂及稳定剂制备碳点金纳米酶，该碳点金纳米酶具有强的拟过氧化酶纳米酶特性，金纳米粒子催化作用氧化底物3,3’, 5, 5’-四甲基联苯胺（TMB）为蓝色o-TMB；α-鹅膏毒肽分子可以占据碳点金纳米酶颗粒表面的活性位点，使碳点金纳米酶的催化作用降低，从而实现α-鹅膏毒肽的可视化快速检测；检测在20分钟以内完成，方法特异性强，且本发明方法具有操作简单、灵敏度高、快速等特点。

本发明目的通过如下技术方案实现的：

1、碳点金纳米酶D-Glu-CDs/AuNPs的制备

（1）称取2-3g柠檬酸、0 .5-1g葡萄糖、50-60μL乙二胺溶于40-50mL超纯水中，超声混合均匀，混合液在160-180℃下加热4-5h后，温度升高至200-220℃继续加热4-5h，反应完成后自然冷却至室温，得棕色溶液；棕色溶液用0.22μm滤膜除去大颗粒杂质，制得葡萄糖碳点；

（2）将质量浓度1-2%的HAuCl₄溶液700-800μL加入到25-30mL的超纯水中，在60-80℃下加热10-15min，再加入0.1-0.5mol/L的柠檬酸钠溶液100-150μL继续加热10-15min后，加入30-50μL葡萄糖碳点，混合5-10s后加入质量浓度1-2%的HAuCl₄溶液300-350μL继续加热10-15min，即得碳点金纳米酶；