[发明专利]基于多重长PCR结合高通量测序同时实现多个同源序列SNP分型的引物、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种基于多重长PCR结合高通量测序同时实现多个同源序列SNP分型的引物、试剂盒及方法。本发明通过跨过同源序列中SNP的侧翼序列(约200bp)，根据特定的引物设计原则设计特异性的多重长PCR扩增引物(2000‑3000bp)，扩增采用特异性和扩增效率较高的聚合酶并参考降落PCR反应条件做多重长PCR反应，多重长PCR产物可用于基于NGS测序平台的SNP分型鉴定。本发明的方法基于多重长PCR反应和巢式多重PCR反应，可同时实现对多个同源序列SNP精准分型，克服了KASP和三引物等位基因PCR技术通量小的缺点；相比于全基因测序，本发明只扩增目的序列，具有较低的成本和较高的性价比。

技术领域

本发明涉及一种基于多重长PCR结合高通量测序同时实现多个同源序列SNP分型的引物、试剂盒及方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

同源序列是指两个序列来源于共同的祖先。同源序列分为旁系同源和直系同源序列。对于二倍体和多倍体，由于有大量的旁系同源序列存在，给真正的SNP鉴定带来一定的挑战。目前有多种方法解决这个问题：如：“采用改进的三引物等位基因扩增法对痛风相关SNP位点的分型研究”，《重庆医学》,2014,42(12):1476–1479；“KASP:a genotyping methodto rapid identification of resistance in Plasmodium falciparum”,Malar J.2021；20:16；“Identification of genome-wide single nucleotide polymorphisms inallopolyploid crop Brassica napus”,BMC Genomics 2013,14:717.等文献介绍的：三引物等位基因PCR，竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR，KASP)或者高深度全基因组测序结合生物信息学分析，能够鉴定出新的或者同源序列中的SNP位点。

三引物等位基因PCR和KASP法适用于规模较小的实验，而针对于大规模样本实验，Sanger测序成本高，工作量大，并且KASP的错误率在0.7-1.6％，从而导致同源序列的SNP位点分型质量不高。高深度的全基因组测序可以有效鉴定同源序列中的SNP位点，但全基因组测序成本过高，不适合大规模使用。因此，如何排除旁系同源序列干扰，是同源序列SNP分析的关键步骤。

发明内容

本发明的目的是：为克服现有同源序列SNP分型面临的同源序列干扰问题：本发明通过跨过同源序列中SNP的侧翼序列(约200bp)，根据特定的引物设计原则设计特异性的多重长PCR扩增引物(扩增产物长度在2000-3000bp)；此外，本发明采用特异性和扩增效率较高的聚合酶做多重长PCR反应，随后的多重长PCR产物可用于基于NGS测序平台的SNP分型鉴定。本发明克服了KASP和三引物等位基因PCR技术通量小的缺点；相比于全基因测序，本发明只扩增目的序列，具有较低的成本和较高的性价比。

为了实现上述目的，本发明提供了一种用于多个同源序列SNP分型的PCR引物组合物，包括：

用于扩增人源8个带有SNP的同源序列区段的8组长多重PCR引物对：SEQ ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4、SEQ ID NO：5～6、SEQ ID NO：7～8、SEQ ID NO：9～10、SEQ ID NO：11～12、SEQ ID NO：13～14和SEQ ID NO：15～16组成的引物对。

优选地，还包括8组针对同源序列SNP位点的巢式多重PCR引物对：SEQ ID NO：17～18、SEQ ID NO：19～20、SEQ ID NO：21～22、SEQ ID NO：23～24、SEQ ID NO：25～26、SEQ IDNO：27～28、SEQ ID NO：29～30和SEQ ID NO：31～32组成的引物对。

优选地，还包括用于index PCR反应的扩增引物：如SEQ ID NO：33～72所示。