[发明专利]基于多重长PCR结合高通量测序同时实现多个同源序列SNP分型的引物、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种用于多个同源序列SNP分型的PCR引物组合物，其特征在于，包括：

用于扩增人源8个带有SNP的同源序列区段的8组长多重PCR引物对：SE Q ID NO：1～2、SEQ ID NO：3～4、SEQ ID NO：5～6、SEQ ID NO：7～8、SEQ ID NO：9～10、SEQ ID NO：11～12、SEQ ID NO：13～14和SEQ ID NO：15～16组成的引物对。

2.如权利要求1所述的用于多个同源序列SNP分型的PCR引物组合物，其特征在于，还包括8组针对同源序列SNP位点的巢式多重PCR引物对：SEQ ID NO：17～18、SEQ ID NO：19～20、SEQ ID NO：21～22、SEQ ID NO：23～24、SEQ ID NO：25～26、SEQ ID NO：27～28、SEQ IDNO：29～30和SEQID NO：31～32组成的引物对。

3.如权利要求1所述的用于多个同源序列SNP分型的PCR引物组合物，其特征在于，还包括用于index PCR反应的扩增引物：如SEQ ID NO：33～72所示。

4.权利要求1～3中任意一项所述的PCR引物组合物在制备用于多个同源序列SNP分型检测试剂盒中的应用。

5.权利要求1～3中任意一项所述的PCR引物组合物在用于非诊断与治疗目的的多个同源序列SNP分型检测中的应用。

6.一种基于多重长PCR结合高通量测序同时实现多个同源序列SNP分型的方法，其特征在于，用于非诊断与治疗目的，包括如下步骤：

步骤1：人源DNA的提取；

步骤2：针对同源序列SNP两翼序列设计长PCR引物，并针对目的区段做长多重PCR反应；对长PCR扩增产物做扩增子捕获建库并测序；

步骤3：针对同源序列的SNP位点，跨越同源序列的两翼序列，设计巢式多重PCR引物，并进行多重巢式PCR反应，对巢式PCR扩增产物做扩增子捕获建库并测序；

步骤4：用含有测序引物和index序列的接头引物作为扩增引物进行index PCR反应，反应结束后，等比混合文库并分选文库进行测序，从而获得SNP分型结果。

7.如权利要求6所述的基于多重长PCR结合高通量测序同时实现多个同源序列SNP分型的方法，其特征在于，所述步骤2中长PCR引物的设计需满足：引物长度在21-27nt，引物Tm值范围在55℃-65℃之间，且上下游引物Tm值相差不超过2℃；引物3’端最后2个碱基为C或G；引物在线blast结果中e-n个数必须小于等于2，e值小于等于0.01少于5个；扩增区段产物长度在2000-3000bp之间；

所述长多重PCR反应体系为：2×Phanta Flash Master Mix 5μL，特异性的引物mix 1μM，DNA样本15ng，无菌水补足至10μL，并加入矿物油覆盖；

所述长多重PCR反应条件为降落PCR反应条件，即退火温度每2个循环降低2度，设置5个循环退火温度梯度，且第5个退火温度进行20个循环。

8.如权利要求7所述的基于多重长PCR结合高通量测序同时实现多个同源序列SNP分型的方法，其特征在于，所述长多重PCR反应的具体条件为：98℃预变性2min；98℃变性10s，68℃退火10s，72℃延申1min 30s，2个循环；；98℃变性10s，66℃退火10s，72℃延申1min 30s，2个循环；98℃变性10s，64℃退火10s，72℃延申1min 30s，2个循环；98℃变性10s，62℃退火10s，72℃延申1min 30s，2个循环；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延申1min 30s，20个循环。