[发明专利]一种环己烯甲酸酯水解酶突变体及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种环己烯甲酸酯水解酶突变体及其制备方法与应用。本发明提供的环己烯甲酸酯水解酶突变体作为催化剂在不对称拆分手性环己烯甲酸酯制备手性环己烯甲酸的应用中，转化率适宜，光学纯度高(手性纯度达99%以上)，反应条件温和，对环境友好，操作简便，收率高，成本低，易于工业放大。因此，本发明的环己烯甲酸酯水解酶突变体及其基因具有良好的工业应用开发前景。

技术领域

本发明涉及一种环己烯甲酸酯水解酶突变体及其制备方法与应用，属于生物医药基因工程技术领域。

背景技术

(S)-3-环己烯-1-甲酸是新型口服抗凝药依度沙班的关键手性中间体。目前，狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应是合成该中间体的主要方法。但是该方法反应条件苛刻，步骤繁琐，收率低导致其生产成本较高。

近年来，环境友好型的生物酶水解拆分法颇受学术界和工业界关注。与化学法相比，酶法反应条件温和，选择性好，收率较高。目前，研究较多的水解酶拆分方法主要来源于两大类，其一是使用来源于动物的酯酶（主要是猪肝酯酶）拆分效果较好，可直接获得(S)-3-环己烯-1-甲酸（Tetrahedron Asymmetry, 2004, 15, 2057-2060）。但是该酶主要从动物中提取，若采用体外表达的方法，只能在Origami系列底盘菌中高效表达，该底盘菌无法实现高密度培养。其次，猪肝酯酶的表达需要分子伴侣，进一步增加猪肝酯酶体外表达难度，因此，动物来源的猪肝酯酶无法大规模应用。 其二酶是来源于微生物的水解酶，该类酶活力比动物来源的酯酶活力高，且能有在BL21(DE3)系列的大肠杆菌底盘菌种高效表达，且易于高密度放大培养。使用微生物来源的水解酶可将环己烯甲酸酯中的(R)-3-环己烯-1-甲酸酯水解而保留(S)-3-环己烯-1-甲酸酯，经NaOH进一步水解，便可获得(S)-3-环己烯-1-甲酸。因此，来源于微生物的水解酶法拆分在工业界应用具有更大的潜力。

目前，对于酶法拆分制备(S)-3-环己烯-1-甲酸酯的来源于微生物的水解酶研究比较有优势的酶是来源于微生物Acinetobacter sp. WCHAc010052（中国专利CN112813131B）和Acinetobacter sp. JNU9335（中国专利CN111778229B）的两种酶。与后者相比，来源于Acinetobacter sp. WCHAc010052的前者具有更高的活性。并且，根据专利CN112813131B的记载，发明人对酶进行了突变，获得了高活性突变体，且对其选择性未见显著影响。申请人经过研究发现，这两种不同的酶均需在水解转化率62%以上时，才能获得满足手性纯度要求的产物（97%）。因此，尽管文献报道的酶的活性较高，但是其选择性较差，影响最终产品收率，从而影响最终的生产成本。因此，继续开发新的高选择性的环己烯甲酸酯水解酶突变体在工业化生产中依然具有实际意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对酶法拆分制备(S)-3-环己烯-1-甲酸酯对映选择性差的问题，提供一个来源于自然界酶突变得到的选择性更高的水解酶，并应用于3-环己烯-1-甲酸酯的拆分。

本发明以来源于Acinetobacter sp. WCHAc010052的水解酶VcHLA002为初始酶，基于Alphafold2蛋白结构建模和结构分析的方法，选取目标位点，进行定点饱和突变，最终获得高选择性的酶突变体。

包括如下步骤：

（1）评估自然界存在的酶的拆分效果

具体为合成来源于菌种Acinetobacter sp. WCHAc010052的水解酶VcHLA002，并对该酶进行酶活力和选择性测试：将合成的VcHLA002甘油菌，37℃培养，25℃表达后，在20℃的条件下，进行酶活力测试。结果表明：该酶具有较高的活性但是选择性较差。因此，需要进行突变获得更好选择性的酶；

（2）将该酶的氨基酸序列使用Alphafold2 进行结构建模与分析；