[发明专利]TK基因缺失的重组猪伪狂犬病毒和其感染性克隆系统、构建方法及应用

说明书

本发明属于病毒基因工程技术领域，公开了TK基因缺失的重组猪伪狂犬病毒（PRV）的感染性克隆系统，所述感染性克隆系统包括5个Fosmid，分别为Fos‑Bartha‑1、Fos‑Bartha‑2‑dTK、Fos‑Bartha‑3‑dTK、Fos‑Bartha‑4和Fos‑Bartha‑5，其中Fos‑Bartha‑2‑dTK和Fos‑Bartha‑3‑dTK是通过将Fos‑Bartha‑2和Fos‑Bartha‑3中的TK基因缺失得来。利用本发明的TK基因缺失多片段感染性克隆系统构建重组PRV效率高、对小鼠无致病性，为今后的PRV Bartha‑K61疫苗载体及基因工程载体研究奠定了重要基础。

技术领域

本发明属于病毒基因工程技术领域，涉及TK基因缺失的重组猪伪狂犬病毒和其感染性克隆系统、构建方法及应用。

背景技术

猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)是一种有囊膜的双链DAN病毒，基因组长约143kb，属于疱疹病毒科(Herpesviridae)、α-疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)。PRV宿主范围广，包括猪、牛、羊、犬、猫以及多种野生动物，其中PRV感染猪可导致仔猪共济失调和大量死亡、妊娠母猪流产和死胎、公猪不育等严重危害。

PRV弱毒疫苗是防控猪伪狂犬病的有效措施，其中Bartha-K61是经典的弱毒疫苗株。由于PRV具有复制非必需区多、可容纳大量外源基因、体外易培养等特点，使得PRV成为了一种有潜力的病毒载体。但是，尽管临床实践中表明PRV Bartha-K61对猪是安全的，对小鼠却高度致死的，这不利于在载体开发中的小动物模型评价。此外，由于PRV基因组庞大，过去在PRV载体研究中，利用传统的同源重组技术或结合CRISPR/cas9技术的同源重组技术构建重组病毒费时费力，往往需要多轮纯化才可获得纯净的重组病毒；利用细菌人工染色体(BAC)感染性克隆技术，BAC构建较为困难。

基因文库是将某一生物的全基因或某部分基因以大小不同的片段克隆到不同的载体，并转移到宿主中。当需要某一基因片段时，可通过某种筛选方法获得包括所需的基因片段的克隆，并可通过宿主的增殖大量获得所需的基因。按载体可插入片段的大小，可将基因文库分为质粒文库、噬菌体文库、Fosmid文库、BAC文库和YAC文库等。Fosmid文库是应用于较广的大片段基因组文库，具有稳定性高、随机性好、拷贝数可控等特点，主要用于基因的克隆、基因组序列测定、物理图谱构建以及比较基因组研究。

因此，提供一种对小鼠安全性高的PRV重组病毒及其基于Fosmid文库的感染性克隆，便于在细菌中对庞大的PRV基因组进行基因的缺失、插入或突变，能够极大提升获得PRV突变体的效率，对PRV载体在基因工程疫苗和基因治疗方面的研究有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供TK基因缺失的重组猪伪狂犬病毒(rPRV-Bartha-dTK)及其感染性克隆系统，采用基于Fosmid文库构建TK基因缺失的PRV多片段感染性克隆系统及重组病毒，具有效率高、周期短的特点，并且可以作为对小鼠安全的病毒载体。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：