[发明专利]TK基因缺失的重组猪伪狂犬病毒和其感染性克隆系统、构建方法及应用

权利要求书

1.TK基因缺失的重组猪伪狂犬病毒感染性克隆系统，其特征在于，所述感染性克隆系统包括5个Fosmid粘粒，分别为Fos-Bartha-1、Fos-Bartha-2-dTK、Fos-Bartha-3-dTK、Fos-Bartha-4和Fos-Bartha-5，其中Fos-Bartha-2-dTK和Fos-Bartha-3-dTK是通过将Fos-Bartha-2和Fos-Bartha-3中的TK基因缺失得来；所述Fos-Bartha-1在猪伪狂犬病毒疫苗株基因组的位置是第1~33021bp，所述Fos-Bartha-2在猪伪狂犬病毒疫苗株基因组的位置是第27809~64672bp，所述Fos-Bartha-3在猪伪狂犬病毒疫苗株基因组的位置是第56119~90917bp，所述Fos-Bartha-4在猪伪狂犬病毒疫苗株基因组的位置是第77241~108242bp，所述Fos-Bartha-5在猪伪狂犬病毒疫苗株基因组的位置是第100085~2080bp；所述猪伪狂犬病毒疫苗株为Bartha-K61。

2.根据权利要求1所述的TK基因缺失的重组猪伪狂犬病毒感染性克隆系统，其特征在于，所述Fos-Bartha-2和Fos-Bartha-3中的TK基因的第19~21位碱基由TAC突变为TAA，第28~30位碱基由TAC突变为TAA，第109~111位碱基由TAC突变为TAA，致使提前引入3个终止密码子，并且TK基因C端的第157~960位碱基完全缺失，TK基因突变后的序列如SEQ ID NO.1所示。

3.利用权利要求1~2任一项所述的TK基因缺失的重组猪伪狂犬病毒感染性克隆系统构建TK基因缺失的重组猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取猪伪狂犬病毒疫苗株Bartha-K61基因组；

2）将打碎的猪伪狂犬病毒疫苗株Bartha-K61基因组DNA片段末端修复后与pCC1FOS载体连接，经过噬菌体包装后感染大肠杆菌获得粘粒；

3）筛选用于拯救病毒的相互重叠且可覆盖Bartha-K61基因组的5个Fosmid粘粒，分别为Fos-Bartha-1、Fos-Bartha-2、Fos-Bartha-3、Fos-Bartha-4和Fos-Bartha-5；

4）将Fos-Bartha-2和Fos-Bartha-3中的TK基因缺失得到重组Fosmid粘粒Fos-Bartha-2-dTK和Fos-Bartha-3-dTK；

5）将TK基因缺失的重组Fosmid粘粒与PRV Bartha-K61亲本病毒感染性克隆系统重新组合，得到TK基因缺失的重组猪伪狂犬病毒病毒感染性克隆系统；

6）将重组猪伪狂犬病毒病毒感染性克隆系统转染Vero细胞，拯救重组猪伪狂犬病毒病毒，得到TK基因缺失的重组猪伪狂犬病毒。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3）中筛选用于拯救病毒的相互重叠且可覆盖Bartha-K61基因组的5个Fosmid粘粒所用的引物对序列如下：

pCC1 F：5’-GGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGG-3‘；

pCC1 R：5’-CTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGC-3‘。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤4）的具体步骤如下：

步骤4.1、将Fos-Bartha-2及Fos-Bartha-3和重组酶质粒pRed E/T电转进DH10B感受态细胞，通过氯霉素和四环素筛选出阳性克隆；

步骤4.2、用rpsl-neo质粒作模板，通过PCR扩增左右各携带TK基因50 bp同源臂的rpsl-neo筛选基因表达盒，将PCR产物电转进含有Fosmid和pRed E/T的DH10B感受态细胞，通过氯霉素、四环素和卡那霉素筛选出阳性克隆；

步骤4.3、用基因合成的dTK质粒作模板，通过PCR扩增左右各携带50 bp同源臂且提前引入3个终止密码子的TK基因N端片段，将PCR产物电转进上一步获得阳性克隆制备的感受态细胞，通过氯霉素和链霉素筛选出阳性克隆，提取重组Fosmid粘粒并测序验证，获得重组Fosmid粘粒Fos-Bartha-2-dTK和Fos-Bartha-3-dTK。