[发明专利]一种同时检测CPV、CDV和CHV抗体的液相芯片试剂盒及方法在审
申请号: | 202211610305.5 | 申请日: | 2022-12-14 |
公开(公告)号: | CN116183914A | 公开(公告)日: | 2023-05-30 |
发明(设计)人: | 陈桂华;伍绮文;郭鹏举 | 申请(专利权)人: | 广东宠健生物科技有限公司 |
主分类号: | G01N33/569 | 分类号: | G01N33/569;G01N33/543;G01N33/533 |
代理公司: | 广州博联知识产权代理有限公司 44663 | 代理人: | 王洪江 |
地址: | 528253 广东省佛山市南海区桂城*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 同时 检测 cpv cdv chv 抗体 芯片 试剂盒 方法 | ||
1.一种同时检测CPV、CDV和CHV抗体的液相芯片试剂盒,其特征在于:包括偶联磁珠组、检测抗体和报告分子;
所述的偶联磁珠组分别由检测犬细小病毒的磁珠CPV-35、检测犬瘟病毒的磁珠CDV-45,检测犬疱疹病毒的磁珠CHV-43组成;
所述的磁珠CPV-35是CPV VP1重组蛋白与第35号磁珠偶联获得;
所述的磁珠CDV-45是CDV天然抗原与第45号磁珠偶联获得;
所述的磁珠CHV-43是CHV天然抗原与第43号磁珠偶联获得。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:所述检测抗体为生物素标记的抗犬IgG抗体。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:所述报告分子为荧光蛋白或荧光素标记的链霉亲和素;
所述荧光蛋白或荧光素选自藻红蛋白、Cy3、Cy5中的一种。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:所述的偶联磁珠的制备方法为:
将3种不同编号的空白磁珠活化后,用偶联缓冲液重悬并分散磁珠,分别加入CPV VP1重组蛋白溶液、CDV天然抗原溶液、CHV天然抗原溶液,混匀后室温避光条件下进行偶联反应2小时,离心去上清,获得3种包被不同抗原的磁珠,即偶联磁珠。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于:所述的偶联缓冲液为50~100mM乙磺酸MES,pH 5.0~6.0。
6.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于:所使用的CPV VP1重组蛋白溶液、CDV天然抗原溶液、CHV天然抗原溶液的浓度为0.3~3mg/mL。
7.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于:所述的空白磁珠活化步骤如下:
(1)、磁珠预处理:取3种不同编号的空白磁珠,离心弃上清,用活化缓冲液重悬磁珠,涡旋10s,再超声10s以打散磁珠,离心后弃上清;
(2)、磁珠的活化:将预处理的磁珠分别用活化缓冲液重悬,涡旋10s,再超声10s以打散磁珠,再依次加入氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐溶液Sulfo-NHS和碳二亚胺溶液EDC,混匀后,室温避光作用20min,以得到活化的磁珠。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于:所述活化缓冲液为100mM NaH2PO4,pH6.2;所述的氮羟基琥珀酰亚胺磺酸盐溶液Sulfo-NHS浓度为50mg/mL;所述的碳二亚胺溶液EDC浓度为50mg/mL。
9.一种同时检测CPV、CDV和CHV抗体的方法,其特征在于:采用权利要求1~8任一所述的液相芯片试剂盒进行检测,具体包括如下步骤:
S1)、偶联磁珠与样品中的抗体结合:将偶联磁珠与预处理的待测样品于室温、避光条件下震荡孵育1~2h,用洗涤缓冲液洗涤3次;
S2)、加入检测抗体及反应:将生物素标记的抗犬IgG抗体加入至上一步反应体系中,于室温、避光条件下震荡孵育30~60min,用洗涤缓冲液洗涤3次;
S3)、结果检测:将报告分子加入到上一步反应体系中,于室温、避光条件下震荡孵育30~60min,用洗涤缓冲液洗涤3次;
S4)、结果检测:往反应体系中加入洗涤缓冲液,室温、避光条件下震荡60s,置于Luminex 200液相芯片系统读取荧光强度;
S5)、结果分析:先计算阴性对照血清的平均荧光强度值和标准差,以阴性血清的平均荧光强度值与3倍标准差的和作为临界值,高于临界值视为阳性。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于:步骤S1)中,所述待测样品为血清样品,待测样品预处理包括将待测样品进行1:10~50倍稀释、过滤;
步骤S1)中,所述偶联磁珠与预处理后的待测样品的体积比为1:(0.8~1.2);
步骤S4)中,所述的洗涤缓冲液为PBS-BN溶液,其pH 7.4;含有如下体积百分比的组分:PBS,0.1%BSA,0.02%Tween-20,0.05%叠氮钠。
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