[发明专利]一种针对人TNFα分子的类风湿关节炎治疗性疫苗的构建

权利要求书

1.一种针对人肿瘤坏死因子α (TNFα)的TNFα-载体蛋白偶联物，其特征在于，所述偶联物具有如式I所示的结构：

(TNFα)n-L-C           （式I）

其中，

TNFα是肿瘤坏死因子α；

C是载体蛋白；

L是连接TNFα和载体蛋白的接头，所述接头是4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)与N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫代丙酸盐(SATP)形成的共价键，并且其中所述sulfo-SMCC与载体蛋白相连，所述SATP与TNFα相连；

n为偶联于所述载体蛋白的TNFα的平均偶联数量，且n为5-7之间的整数或非整数；和

“-”为键；

其中，所述载体蛋白是白喉毒素突变体CRM197。

2.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述TNFα是人TNFα的全长序列。

3.一种制备如权利要求1所述的偶联物的方法，其特征在于，包括步骤：

(a) 用N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫代丙酸盐(SATP)化学修饰TNFα抗原，再经脱酰基步骤添加羟胺酸脱去SATP上的酰基形成游离巯基；反应完成后，分离获得TNFα抗原中间体；

(b) 用双功能偶联剂4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)修饰载体蛋白，使得所述载体蛋白带有马来酰亚胺基团；反应完成后，添加氨基酸终止反应，并分离获得载体蛋白中间体；和

(c) 将步骤(a)和步骤(b)中分别获得的TNFα抗原中间体与载体蛋白中间体混合，进行偶联反应，从而获得所述的偶联物；反应完成后，添加氨基酸终止反应；其中，所述TNFα抗原中间体与载体蛋白中间体混合的比例为摩尔比5:1至7:1。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述的TNFα抗原与SATP反应时的添加比例为摩尔比1:20至1:200。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，所述TNFα抗原中间体与载体蛋白中间体混合的比例为摩尔比6:1。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，在TNFα抗原与SATP开始反应20-120 min后，向反应体系中添加脱酰基试剂，脱酰基反应时间为1-6小时。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在TNFα抗原与SATP开始反应30-90 min后，向反应体系中添加脱酰基试剂。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在TNFα抗原与SATP开始反应60 min后，向反应体系中添加脱酰基试剂。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述脱酰基反应时间为1-4小时。

10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述脱酰基反应时间为2小时。

11.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，所述偶联反应的条件为：0-30℃反应12-16小时。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述偶联反应的条件为：2-8℃。

13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述偶联反应的条件为：4℃。

14.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，反应完成后所添加的氨基酸是甘氨酸，添加浓度为1-1000 mM。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述甘氨酸的添加浓度为100 mM。