[发明专利]一种利用基因编辑获得番茄材料表型标记的方法

说明书

本发明公开了一种利用基因编辑获得番茄材料表型标记的方法，属于作物遗传育种领域。该方法包括sgRNA靶点设计，构建CRISPER/Cas9重组质粒，再将该重组质粒转入农杆菌，侵染番茄材料，经筛选验证获得缺失SlNAC2基因功能且无外源基因插入的番茄纯合突变体材料，所述番茄纯合突变体材料的种子胚轴出现颜色表型标记。本发明利用CRISPER‑Cas9基因编辑系统在目标番茄材料中敲除SlNAC2基因，使目标材料的后代种子萌发时，下胚轴出现明显紫色区段，将该现象作为表型标记，可以在被标记材料种子萌发初期对其进行快速鉴别，为品种鉴定、纯度鉴定、遗传背景标记识别等奠定基础。

技术领域

本发明涉及作物遗传育种领域，特别是涉及一种利用基因编辑获得番茄材料表型标记的方法。

背景技术

在植物研究中，尤其是在对种质资源进行研究的过程中，通常会用到针对不同材料的标记，如最常见的形态学标记和分子标记，这些标记可以快速精确的鉴别出目标材料，对于种质资源的鉴定和新品种选育具有重要意义。形态标记作为一种易于识别的多态性形式，在遗传多样性分析、植物亲缘关系鉴定与良种选育等方面具有非常重要的作用，亦可作为其他标记方式的重要参考。形态学标记一般来自于对野生种质资源表型的观察比较，或加以简单的性状连锁或遗传分析等，属于自然变异性状，这类标记虽具有直观、快速、简便的特点，但目前单纯的形态学标记依旧存在可供标记、分析的位点过少，部分性状不通用，植株形态易受外部环境影响，遗传稳定性不一致等不足之处，因此开发一种新的、表型稳定易识别且可人为定向标记的表型标记方法对资源区分和育种实践意义重大。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用基因编辑获得番茄材料表型标记的方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明利用CRISPER-Cas9基因编辑系统对番茄材料中的SlNAC2基因进行编辑，使得番茄材料的种子下胚轴出现颜色表型标记，该方法能够在番茄育种中进行材料早期定向选择，加快育种速度，同时为品种鉴定、纯度鉴定、遗传背景标记识别等奠定基础。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种利用基因编辑获得番茄材料表型标记的方法，包括利用CRISPER-Cas9基因编辑系统对番茄材料中的SlNAC2基因进行编辑，使得番茄材料的种子胚轴出现颜色表型标记的步骤。

进一步地，具体步骤如下：

(1)sgRNA靶点设计：根据如SEQ ID NO：1所示的SlNAC2基因序列设计两个sgRNA靶点，第一个sgRNA靶点序列如SEQ ID NO：3所示，第二个sgRNA靶点序列如SEQ ID NO：4所示；

(2)构建CRISPER/Cas9重组质粒：以YLgRNA-U3b/U3d质粒为模板，分别利用如SEQID NO：5-14所示的引物进行两轮PCR扩增，获得两个sgRNA靶点的表达盒；将两个所述sgRNA靶点的表达盒与CRISPR/Cas9载体连接，获得CRISPER/Cas9重组质粒；

(3)将所述CRISPER/Cas9重组质粒转入农杆菌，侵染番茄材料，经筛选验证获得缺失SlNAC2基因功能且无外源基因插入的番茄纯合突变体材料，所述番茄纯合突变体材料的种子胚轴出现颜色表型标记。

进一步地，在步骤(2)中，以YLgRNA-U3b/U3d质粒为模板，利用如SEQ ID NO：5-10所示的引物进行第一轮PCR扩增，之后以第一轮PCR扩增产物为模板，利用如SEQ ID NO：11-14所示的引物进行第二轮PCR扩增，将扩增产物回收纯化，获得两个sgRNA靶点的表达盒。