[发明专利]一种利用基因编辑获得番茄材料表型标记的方法

权利要求书

1.一种利用基因编辑获得番茄材料表型标记的方法，其特征在于，包括利用CRISPR-Cas9基因编辑系统对番茄材料中的SlNAC2基因进行编辑，使得番茄材料的种子胚轴出现颜色表型标记的步骤；

（1）sgRNA靶点设计：根据如SEQ ID NO：1所示的SlNAC2基因序列设计两个sgRNA靶点，第一个sgRNA靶点序列如SEQ ID NO：3所示，第二个sgRNA靶点序列如SEQ ID NO：4所示；

（2）构建CRISPR/Cas9重组质粒：以YLgRNA-U3b/U3d质粒为模板，分别利用如SEQ IDNO：5-14所示的引物进行两轮PCR扩增，获得两个sgRNA靶点的表达盒；将两个所述sgRNA靶点的表达盒与CRISPR/Cas9载体连接，获得CRISPR/Cas9重组质粒；

（3）将所述CRISPR/Cas9重组质粒转入农杆菌，侵染番茄材料，经筛选验证获得缺失SlNAC2基因功能且无外源基因插入的番茄纯合突变体材料，所述番茄纯合突变体材料的种子胚轴出现颜色表型标记。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中，以YLgRNA-U3b/U3d质粒为模板，利用如SEQ ID NO：5-10所示的引物进行第一轮PCR扩增，之后以第一轮PCR扩增产物为模板，利用如SEQ ID NO：11-14所示的引物进行第二轮PCR扩增，将扩增产物回收纯化，获得两个sgRNA靶点的表达盒。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，第一轮PCR扩增的体系为：KOD One™ PCRMaster Mix 25µL、H₂O 18µL、YLgRNA-U3b/ U3d 4µL、上下游引物各1.5µL；第二轮PCR扩增的体系为：KOD One™ PCR Master Mix 25µL、H₂O 21µL、10 µmol/L通用混合引物3µL、DNA模板 1µL。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，两轮PCR扩增的反应程序均为：98℃ 10s；58℃ 5s，68℃ 1s，35个循环；4℃保存。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中，用T4 DNA连接酶连接两个所述sgRNA靶点的表达盒与CRISPR/Cas9载体，获得CRISPR/Cas9重组质粒。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述T4 DNA连接酶连接的体系为：10×CutSmart Buffer 1.5µL、10mmol/L ATP 1.5µL、pYLCRISPR/Cas9质粒 1µL、两个sgRNA靶点的表达盒各1µL、Bsa I-HF 0.5µL、T4 DNA ligase 0.5µL和H₂O 8µL；所述T4 DNA连接酶连接的条件为：37℃ 5min，10℃ 5min，20℃ 5min，10~15个循环；37℃ 5min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述番茄纯合突变体材料的种子下胚轴出现紫色表型标记。

8.一种如权利要求1-7任一项所述的方法在番茄种质资源鉴定中的应用。

9.一种如权利要求1-7任一项所述的方法在番茄育种中的应用。