[发明专利]一种基于SNP位点的简单多重KASP基因分型方法及应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种基于SNP位点的简单多重KASP基因分型方法，包括：根据SNP位点Nk设计两条上游引物，同时在SNP每个位点Nk下游段设计一条通用反向引物；分别配制P1、P2亲本类型的多重引物反应体系X1、X2，X1和X2同P1、P2及后代个体模板最终配制成PCR反应体系；用亲本P1、P2、及10‑20个P1和P2衍生的后代个体进行多重PCR验证；利用X1和X2对亲本P1和P2杂交所得的后代个体进行基因分型。本发明的简单多重KASP基因分型方法，对仪器没有太高的要求，无需测序，并且用普通的琼脂糖电泳即可完成带型区分，可以一次实现对多个基因位点同时分型的目的，成本低。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种基于SNP位点的简单多重KASP基因分型方法及应用。

背景技术

随着测序技术的发展，测序的成本越来越低，测序可以获得大量的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)位点以及插入缺失(Insertion-deletionInDel)位点，基于SNP/InDel开发分子标记较SSR等常规的分子标记数量、密度要高很多，为育种家进行开发和目标性状紧密连锁的分子标记以及对目标基因的进行精细定位提供了可能性，然而常见的CAPS标记依赖酶切，受酶切位点的限制，dCAPS需要借助聚丙烯酰胺胶进行分型，KASP可实现高通量分型，但所需的荧光引物合成贵，而且分析需要借助专门的荧光PCR仪器，也限制了实验室条件一般的科技人员的使用。基于测序的多重PCR技术的高通量SNP标记可以同时进行多个标记分型，但需要依赖测序。本研究旨在结合KASP标记和多重PCR技术优点，开发一种多重简单KASP分子标记：多重简单竞争性等位基因特异性PCR技术(Multiplex Simple Kompetitive Allele Specific PCR MSKASP)，该方法不需要依赖昂贵的仪器，也不需要依赖测序，仅需要普通的PCR仪以及琼脂糖电泳即可达到对个体基因型分型的目的，不仅节约成本，而且操作简单方便，更适合小型实验室使用，同时也可以实现高通量的目标。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于SNP位点的简单多重KASP基因分型方法及应用，该方法不需要依赖昂贵的仪器，也不需要依赖测序，仅需要普通的PCR仪以及琼脂糖电泳即可达到对个体基因型分型的目的。

为实现上述目的，本发明提供了一种基于SNP位点的简单多重KASP基因分型方法，包括以下步骤：

(1)根据SNP不同位点Nk设计上游引物，每个位点设计两条上游引物，一条引物序列的末端与其中显性亲本P1位点序列相同，记作PrimerNkF1；一条引物序列的末端同隐性亲本P2位点序列相同，记作PrimerNkF2；同时在SNP每个位点Nk下游段设计一条条通用反向引物，记作PrimerNkR；引物对PrimerNkF1和PrimerNkR作为标记P1亲本第Nk个SNP位点基因型的引物，记作PriNkP1；引物对PrimerNkF2和PrimerNkR作为标记P2亲本第Nk个SNP位点基因型的引物，记作PriNkP2；

(2)利用两个亲本P1和P2的模板，以及两个亲本的F1代对步骤(1)设计的引物进行验证；

(3)用亲本P1、P2、及10-20个P1和P2衍生的后代个体(已经确定每个后代个体SNP位点基因型)进行多重PCR验证：分别配制P1、P2亲本类型的多重引物反应体系，用P1亲本类型的引物对配制P1类型的多重PCR扩增体系X1；用P2亲本类型的引物对配制P2类型多重引物反应体系X2；X1和X2同P1、P2及后代个体模板最终配制成PCR反应体系；