[发明专利]一种基于SNP位点的简单多重KASP基因分型方法及应用

权利要求书

1.一种基于SNP位点的简单多重KASP基因分型方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）根据SNP不同位点Nk设计上游引物，每个位点设计两条上游引物，一条引物序列的末端与其中显性亲本P1位点序列相同，记作PrimerNkF1；一条引物序列的末端同隐性亲本P2位点序列相同，记作PrimerNkF2；同时在SNP每个位点Nk下游段设计一条通用反向引物，记作PrimerNkR；引物对PrimerNkF1和PrimerNkR作为标记P1亲本第Nk个SNP位点基因型的引物，记作PriNkP1；引物对PrimerNkF2和PrimerNkR作为标记P2亲本第Nk个SNP位点基因型的引物，记作PriNkP2；

（2）利用两个亲本P1和P2的模板，以及两个亲本的F1代对步骤（1）设计的引物进行验证；

（3）用亲本P1、P2、及10-20个P1和P2衍生的后代个体进行多重PCR验证：分别配制P1、P2亲本类型的多重引物反应体系，用P1亲本类型的引物对配制P1类型的多重PCR扩增体系X1；用P2亲本类型的引物对配制P2类型多重引物反应体系X2；X1和X2同P1、P2及后代个体模板最终配制成PCR反应体系；

（4）把步骤（3）扩增完成的反应体系用1%的琼脂糖胶进行电泳分型，满足以下条件可进一步用于P1和P2后代个体基因型的鉴定：多重体系X1基因分型结果为分型P1出带，分型P2不出带，分型F1和P1结果一致；多重体系X2基因分型结果为分型P2出带，分型P1不出带，分型F1和P2结果一致；

（5）利用X1和X2对亲本P1和P2杂交所得的后代个体进行基因分型，将X1和X2同亲本P1和P2杂交所得的后代个体模板配制成PCR反应体系，用1%的琼脂糖胶进行电泳分型，判定标准为：

若X1基因分型有带，X2基因分型无带，则为P1的基因型个体；

若X1基因分型无带，X2基因分型有带，则为P2的基因型个体；

若X1基因分型有带，X2基因分型有带，则为杂合基因型个体。

2.根据权利要求1所述的简单多重KASP基因分型方法，其特征在于，所述步骤（1）中，引物设计满足以下条件：

A1.每个引物退火温度相差在±2℃内；

A2.N1-Nk个标记扩增出来的目标片段大小不同，以有利于用琼脂糖电泳区分为宜；

A3.引物序列之间不存在容易形成引物二聚体的结构。

3.根据权利要求1所述的简单多重KASP基因分型方法，其特征在于，所述步骤（2）中，验证引物能够：每对引物不存在非特异性扩增，且扩增清晰；PriNkP1引物扩增亲本P1模板能出带，扩增亲本P2不能出带；PriNkP2引物扩增亲本P2模板能出带，扩增亲本P1模板不出带；PriNkP1和PriNkP2扩增F1模板均能出带。

4.根据权利要求1所述的简单多重KASP基因分型方法，其特征在于，所述步骤（3）中，配制PCR反应体系时，可先按照i/1ul的量加入i对引物混合，如果扩增效果不佳，再调试引物浓度及其他反应体系条件；用来混合用的每对引物扩增出来的片段大小不同，且容易通过琼脂糖电泳分辨。

5.根据权利要求1所述的简单多重KASP基因分型方法，其特征在于，所述步骤（5）中，将每个个体i位点的基因型表示方式为xy，其中x代表X1分型的基因型，值为0或者1，0代表无带，1代表有带；y代表X2分型的基因型，值为0或者1，0代表无带，1代表有带；分型结果为10、01、11分别代表P1的基因型个体、P2的基因型个体、杂合基因型个体，基因型分别表示为2、0、1。

6.如权利要求1~5任一项所述的简单多重KASP基因分型方法在农作物育种中的应用。