[发明专利]基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法及植株的倍性鉴定

权利要求书

1.一种基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)选取杂交一代辣椒品种，在盛花期选取处于单核靠边期的花蕾，装入自封袋中置于4℃环境中24～48h；

(2)取出花蕾，经流水冲洗后，置于超净工作台中用75％酒精消毒30～35s，再用0.1％升汞杀菌10～15min，最后用灭菌的超纯水冲洗；

(3)在超净工作台上，将消毒后的花蕾置于无菌滤纸上，待吸干其表面水分后剥开花蕾，取出花药；

(4)将取出的花药接种于装有诱导培养基的三角瓶中，每瓶接种5～6个花粉粒，将三角瓶封口；

(5)接种后随即放入32～35℃的恒温培养箱中暗培养2～5d后，置于温度25℃、光照强度2000～2500lx、光照时间16h/d的培养室进行40～60d培养；

(6)待出苗后转入生根培养基中进行生根处理；待根部发育完全后，开盖练苗，清洗根部培养基，移入营养钵。

2.根据权利要求1所述的基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法，其特征在于，所述步骤(1)中，取蕾时间和选择标准：每天上午8：00以前或下午5：00以后从田间摘取生长健壮无病虫害的植株花蕾，花蕾的形态以“花瓣与花萼等长”或“花瓣露出花萼不超过2mm”为标准；每次从3～5株植株上取蕾，避免植株间差异；每隔3～4d摘除已开放的花朵，让植株始终处于开花状态。

3.根据权利要求1所述的基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法，其特征在于，所述步骤(1)中，应用滂酰紫6R染色法鉴定辣椒小孢子的具体发育时期，从中筛选出处于单核靠边期的花蕾。

4.根据权利要求1所述的基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将花蕾进行消毒，流水冲洗20min后，在超净工作台中用75％酒精消毒30～35s，再用0.1％升汞杀菌10～15min，最后用灭菌的超纯水冲洗3次，每次5min。

5.根据权利要求1所述的基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法，其特征在于，所述步骤(3)中，用灭菌后的镊子和解剖刀剥开花蕾，取出花药；并且过程中，注意避免损伤、损坏花药，并把花丝去除干净。

6.根据权利要求1所述的基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法，其特征在于，所述步骤(4)中，诱导培养基的配方为：MS+3％蔗糖+0.8％琼脂+0.01～0.08mg/L BR+1～3mg/LTDZ+1～2mg/L AGP，pH5.8。

7.根据权利要求6所述的基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法，其特征在于，所述诱导培养基的制备方法为：首先，在MS培养基中添加3％蔗糖、0.8％琼脂，并将该培养基pH调为5.8；接着，将培养基于121℃、1.1MPa条件下灭菌20min后，冷却至60～70℃；冷却后，将0.01～0.08mg/L的BR、1～3mg/L的TDZ以及1～2mg/L的AGP采用过滤灭菌的方法加入上述冷却后的培养基中；最后，对培养基进行分装，每100mL三角瓶中倒入30～40mL的培养基。

8.根据权利要求1所述的基于胚状体途径的辣椒花药培养新方法，其特征在于，所述步骤(5)中，生根培养基的配方为：1/2MS+30g/蔗糖+8g/L琼脂+2mg/LNAA，pH5.8。

9.一种辣椒再生植株的倍性鉴定方法，其特征在于，采用该方法对权利要求1～8任一所述方法获得的辣椒单倍体再生植株进行倍性鉴定，具体方法为：

(1)植物形态学鉴定：

以“叶片小、节间缩短、生活力弱、花蕾不结实”这些外观表型特征为选择标准，对培养的各辣椒再生植株进行初步筛选，获得初步筛选疑似单倍体辣椒；

(2)流式细胞术鉴定：

称量出筛选的初步筛选疑似单倍体辣椒叶片，放置在已经提前预冷的培养皿中；加入解离液，使整个叶片全部浸没在解离液中，使细胞核能充分解离；接着，用单面刀片切成长条状，切碎后吸取培养皿中的解离液，以使叶片中的细胞核进入解离液，再加入解离液进行稀释；最后，将稀释液移置流式细胞试管中，上机测定。

10.根据权利要求9所述的辣椒再生植株的倍性鉴定方法，其特征在于，所述步骤(1)中，疑似单倍体辣椒的外观表型特征“叶片小、节间缩短、生活力弱、花蕾不结实”，均相对于二倍体植株的表型而言。