[发明专利]双级扩大DNA级联循环系统及其应用

说明书

本发明公开了一种双级扩大DNA级联循环系统及其应用，通过CAR+CHA+HCR构建一个精确成像系统。通过“CAR”组合链对目标物进行计算从而决定是否释放miR‑21，达到对癌细胞的精准检测。所属的放大系统由“CHA+HCR”双循环组成，CHA由发夹型探针Hsubgt;1/subgt;、Hsubgt;2/subgt;组成，在miR‑21存在的情况下开启CHA循环，形成的Hsubgt;1/subgt;和Hsubgt;2/subgt;双链体会打开HCR循环，从而显示出荧光信号。HCR循环由Hsubgt;3/subgt;，Hsubgt;3free/subgt;和Hsubgt;4/subgt;组成，两个循环各司其职，又互相成就，最终组合成了CHA+HCR双方大系统。使得荧光信号得到进一步的增强。

技术领域

本发明属于癌症检测技术领域，尤其涉及一种双级扩增系统及其应用。

背景技术

在世界各国，癌症已迅速成为死亡的主要原因，死亡率超过了中风和冠心病。根据《2020年癌症统计》，在全球范围内，2020年估计有1930万新病例和1000万癌症死亡病例。(2020年癌症统计数据)。(据估计，2020年全球将有1000万人死于癌症，1930万新确诊病例，癌症仍然是全球医疗保健的一个重大负担，但尚未得到解决。而通过准确的诊断和随后有效的治疗干预，癌症死亡率可以大大降低。准确识别癌细胞是癌症诊断的必要前提，可以促进及时治疗，大幅提高患者生存期。最近对癌症检测的研究集中在与癌细胞相关的生物标记的成像，可能是细胞表面蛋白质，细胞内基因内容或蛋白质。然而，确保癌症检测准确性的主要挑战包括癌细胞中生物标记物丰度低，以及这些生物标记物在癌细胞中的非特异性表达。由于生物标志物丰度低，一对一信号输出策略往往无法给出清晰的图像信号，导致假阴性结果和脱靶副作用。

自1993年在Caenorhabditis elegans中发现miRNA以来，已经在人类中发现了6个超过2000个miRNA，它们被认为作为后转录调控因子参与了超过30％的蛋白质编码基因的调控。在分子机制上，miRNAs通过减弱基因表达，诱导核糖核酸(RNA)切割和翻译抑制，主要通过RNA干扰(RNAi)途径将碱基配对到目标mrna的3'-非翻译区(UTR)，从而抑制编码蛋白的合成。miRNAs参与调控早期发育、细胞分化、增殖、凋亡、发育时间、造血等生物学过程的多种通路，其表达模式受时间和空间的调控，miRNAs的异常表达与人类的各种疾病密切相关，如脂质代谢紊乱和癌症的发生、发展、转移以及治疗的耐药性。因此，miRNAs被认为是具有临床价值的潜在诊断和预后生物学标记和有前途的药物和基因治疗靶点。敏感、选择性检测microRNA表达水平对癌症的早期诊断、分期和监测具有重要意义。特别是，具有高空间分辨率的亚细胞位置和特定miRNAs分布的原位可视化对于理解miRNAs的生物学功能、药物靶点的发现和个性化治疗具有重要价值。然而，由于miRNAs具有体积小、家族成员序列同源性、在总RNA样本中丰度低等特点，对癌症相关miRNAs的准确分析仍具有挑战性。看起来，由于细胞内极其复杂，活细胞内miRNA的真正高效的原位成像至今仍未被探索。

通过基于DNA级联电路的等温扩增，如催化发夹组装(CHA)、熵驱动催化(EDC)和杂交链式反应(HCR)，提高癌症细胞中低丰度生物标记物原位荧光成像的灵敏度，已经投入了大量的努力。这些扩增方法进行一对多的信号输出，允许单个目标分子通过程序化DNA组装或DNA链生长聚合反应激活多个信号分子，仅使用几个人工可编程DNA序列就为无酶信号扩增铺平了道路。

克隆、微阵列和定量逆转录实时聚合酶链反应(qRT-PCR)被广泛用于miRNA的鉴定和定量。然而，这些方法通常存在灵敏度有限、交叉杂交、容易出错的扩增，以及由于设计短miRNA引物的困难而缺乏有效的内部控制。此外，它们不适合在温和的生理条件下进行生物传感应用，尤其是细胞内成像。其他技术，如比色法、荧光、化学发光、表面增强拉曼光谱、电化学测量和质谱等也经常被开发，基于纳米粒子的分析和深度测序也被用于miRNA的检测。