[发明专利]一种CAR-NK细胞及其制备方法

说明书

本发明涉及医药领域，特别是涉及一种CAR‑NK细胞及其制备方法，将包含编码CAR的核酸构建体感染培养了5~8天的NK细胞，感染后继续培养获得CAR‑NK细胞；所述NK细胞通过下述方法获得：将待扩增的NK细胞接种至已包被抗CD16抗体和抗NKp46抗体的细胞培养容器中培养即获得所述NK细胞，所述抗NKp46抗体的包被浓度为5μg/ml~15μg/ml。本发明的CAR‑NK细胞制备方法安全性高、NK细胞纯度高、扩增倍数高、CAR阳性率显著增加，大大降低成本，NK细胞所含的比例均达到98%以上，CAR阳性率提高2‑3倍，NK活化比例达到85%以上。

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是涉及一种CAR-NK细胞及其制备方法。

背景技术

NK细胞是一类对肿瘤细胞具有强力杀伤作用且MHC非依赖的淋巴细胞，其对肿瘤细胞的识别主要依赖于其表面活化性受体和抑制性受体的相互交叉调控。当识别肿瘤细胞之后，NK细胞通过释放杀伤介质穿孔素和颗粒酶使靶细胞凋亡、表达膜TNF家族分子诱导靶细胞凋亡和抗体依赖的细胞毒作用等多种途径杀伤肿瘤细胞。通过CAR修饰NK细胞有望增强其靶向杀伤肿瘤细胞的能力并研制出具有强大抗肿瘤作用的效应细胞。

目前，针对NK的扩增培养主要有两种方式：1）采用滋养层细胞进行NK细胞的扩增培养，扩增倍数高，但具有风险性；2）采用纯因子方式进行NK细胞扩增培养，安全性高但扩增倍数远不及滋养层培养方法。而且常规的慢病毒转导方式获得的转导效率不高。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种CAR-NK细胞及其制备方法，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种NK细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将待扩增的NK细胞接种至已用抗CD16抗体和抗NKp46抗体包被液包被的细胞培养容器中培养，所述抗NKp46抗体包被液的浓度为5μg/ml~15μg/ml。

本发明还提供所述制备方法获得的NK细胞。

本发明还提供一种CAR-NK细胞的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将包含编码CAR的核酸构建体感染培养了5~8天的所述NK细胞，感染后继续培养获得CAR-NK细胞。

本发明还提供抗NKp46抗体在扩增NK细胞或CAR-NK细胞中的用途。

如上所述，本发明的CAR-NK细胞及其制备方法，具有以下有益效果：CAR-NK细胞制备及扩增方法安全性高、NK细胞纯度高、扩增倍数高、CAR阳性率显著增加，大大降低成本，NK细胞所含的比例均达到98%以上，CAR阳性率提高2-3倍，NK活化比例达到85%以上，该方法简单、高效、有利于规模化生产。

附图说明

图1显示为本发明的总细胞扩增倍数，图中MockNK为未转导慢病毒的NK细胞。

图2显示为本发明的NK细胞扩增倍数。

图3显示分别为CAR-NK组流式检测NK细胞纯度和各组NK细胞纯度统计柱状图。

图4显示为分别为CAR-NK组、对照组2和对照组3细胞的CAR阳性率。

图5显示为NK细胞表面活化标志CD16。

图6显示为细胞表面活化标志NKG2D。

图7 显示为CAR-NK细胞与K562细胞共培养后IL-2分泌检测结果；

图8 显示为CAR-NK细胞对K562的杀伤检测结果。

具体实施方式