[发明专利]一种检测花生抗咪唑啉酮类除草剂基因AhALS-G1709T的引物与应用

权利要求书

1.一种检测花生抗咪唑啉酮类除草剂基因AhALS-G1709T的CAPS分子标记引物，其特征在于，所述CAPS分子标记引物的核苷酸序列如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2所示。

2.权利要求1所述的CAPS分子标记引物在花生育种中的应用。

3.权利要求1所述的CAPS分子标记引物在鉴定抗咪唑啉酮类除草剂花生品种中的应用。

4.权利要求1所述的CAPS分子标记引物在鉴定花生抗咪唑啉酮类除草剂基因AhALS-G1709T中的应用。

5.根据权利要求2-4任意一项所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

S1、提取待测花生基因组DNA；

S2、采用所述CAPS分子标记引物对提取的待测花生基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；

S3、将扩增产物用MfeI限制性内切酶进行酶切，获得酶切产物；

S4、酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据酶切产物的带型判断待测花生的基因型。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述根据酶切产物的带型判断待测花生的基因型包括以下情况：

1)、电泳检测酶切产物含有分子量为1065bp一种条带时，则待测花生为不含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因AhALS-G1709T的纯合型除草剂敏感型花生；

2)、电泳检测酶切产物含有分子量为769bp、296bp两种条带时，则待测花生为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因AhALS-G1709T的纯合型抗性花生；

3)、电泳检测酶切产物含有分子量为1065bp、769bp和296bp三种条带时，则待测花生为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因AhALS-G1709T的杂合型抗性花生。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述S2中PCR扩增的反应体系以50μL计，包括：2×Taq MasterMix 20μL，上、下游引物各2.5μL，DNA溶液5μL，ddH₂O 20μL；所述S2中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸反应30s，共35个循环，72℃延伸10min；所述S3中酶切的反应体系以20μL计，包括：MfeI限制性内切酶3μL，酶反应缓冲液1μL，PCR产物6μL，ddH₂O 10μL，酶切的反应程序为：37℃静置酶切，酶切反应时间为1h。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以不具有咪唑啉酮类除草剂抗性的品种为母本、以含有花生抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因AhALS-G1709T的品种为父本进行杂交，得到F1单株，用所述CAPS分子标记引物，对F1单株进行抗性基因PCR扩增，将扩增产物用MfeI限制性内切酶进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将F1单株中含有分子量为1065bp、769bp和296bp三种条带的单株判定为真杂种，即为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因AhALS-G1709T的杂合型植株，继续自交繁殖F2代；将F1单株中仅含有1065bp一种条带的单株判定为假杂种，为不含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因AhALS-G1709T的纯合型除草剂敏感型母本株。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，用所述CAPS分子标记引物，对所述F2代植株进行抗性基因PCR扩增，将扩增产物用MfeI限制性内切酶进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将F2代植株中含有分子量为769bp、296bp两种条带的单株继续自交，自交后代即为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因AhALS-G1709T的纯合型F3代种子；将F2代植株中含有分子量为1065bp、769bp和296bp三种条带的单株判定为含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因AhALS-G1709T的杂合型的单株，可继续自交繁殖F3代，直至获得含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因AhALS-G1709T纯合型单株。

10.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以含有花生抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因AhALS-G1709T的品种为父本、以普通品种为母本进行杂交，获得F1，然后以普通品种为轮回亲本，在每次回交世代前，用所述CAPS分子标记引物，对各代植株进行抗性基因PCR扩增，将扩增产物用MfeI限制性内切酶进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将含分子量为1065bp、769bp、296bp三种条带的携带含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因AhALS-G1709T的杂合型单株与轮回亲本回交，通过多次回交，在最后一代自交的群体中用所述CAPS分子标记引物对抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因AhALS-G1709T进行分子标记辅助基因型选择，选择含分子量为769bp、296bp两种条带的含抗咪唑啉酮类除草剂抗性基因AhALS-G1709T的纯合型单株，即培育出抗咪唑啉酮类除草剂花生品种。