[发明专利]一种生产衣康酸的里氏木霉工程菌的构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种生产衣康酸的里氏木霉工程菌的构建方法及应用，属于生物工程领域。上述构建方法包括以下步骤：(1)以不产衣康酸的丝状真菌里氏木霉菌或者里氏木霉菌来源的衍生菌为出发菌株，导入编码顺式乌头酸脱羧酶和线粒体三羧酸转运蛋白的外源基因，获得菌株I；(2)过表达所述菌株I的内源膜转运蛋白，获取产衣康酸的里氏木霉工程菌。本发明通过基因改造获得里氏木霉工程菌，该工程菌能以葡萄糖、甘油、液化淀粉、纤维素、纤维素水解液等常见物质为碳源，直接发酵生产大量衣康酸，摇瓶发酵最高产量可达60g/L。可见，本发明为微生物来源的衣康酸的生产提供了新的方法，可应用于衣康酸的工业化生产。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别是涉及一种生产衣康酸的里氏木霉工程菌的构建方法及应用。

背景技术

衣康酸，又称亚甲基琥珀酸或亚甲基丁二酸，是一种重要的不饱和二羧酸，被广泛应用于乳胶、塑料、树脂等高价值化学品的生产。衣康酸具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗病毒等特性，在医学、畜牧养殖业具有良好的应用前景。此外，衣康酸还是生产潜在生物燃料3-甲基四氢呋喃的中间体，具有替代石油基甲基丙烯酸和丙烯酸的巨大潜力。

工业化生产衣康酸是通过微生物发酵实现的，工业化生产的主要菌种是土曲霉。在发酵罐中，土曲霉发酵生产衣康酸的产量已达130～160g/L。玉米黑粉菌是一种担子菌，也具有生产衣康酸的能力。

里氏木霉的优势：里氏木霉作为重要的工业生产菌株，是GRAS(GenerallyRegarded as Safe)菌株，非常适合工业化放大生产，已被广泛应用于食品、饲料等发酵行业。然而由于里氏木霉菌株不能生产衣康酸，因此，本发明通过基因改造技术，构建里氏木霉工程菌株用于衣康酸的发酵生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产衣康酸的里氏木霉工程菌的构建方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，该里氏木霉工程菌可以生产大量的衣康酸，为微生物来源的衣康酸提供了新的方法。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种里氏木霉工程菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)以不产衣康酸的丝状真菌里氏木霉菌或者里氏木霉菌来源的衍生菌为出发菌株，导入编码顺式乌头酸脱羧酶和线粒体三羧酸转运蛋白的外源基因，获得菌株I；

(2)过表达所述菌株I的内源膜转运蛋白，获取产衣康酸的里氏木霉工程菌。

优选的是，所述出发菌株包括里氏木霉菌QM6a，QM9414，Rut-C30，RL-P37，NG14以及PC-3-7。

优选的是，所述线粒体三羧酸转运蛋白和顺式乌头酸脱羧酶源自于土曲霉注释的具有表达线粒体三羧酸转运蛋白功能和顺式乌头酸脱羧酶功能的蛋白编码基因。

所述顺式乌头酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码所述顺式乌头酸脱羧酶的基因序列如SEQ ID NO.2所示；所述线粒体三羧酸转运蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.5所示，编码所述线粒体三羧酸转运蛋白的基因序列如SEQ ID NO.6所示。

优选的是，所述内源膜转运蛋白为mfs超家族转运蛋白；编码所述内源膜转运蛋白的基因包括mfs1、mfs2、mfs3、mfs4、mfs5，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。

本发明还提供一种里氏木霉工程菌，由所述的构建方法构建而成。

本发明还提供一种生成衣康酸的方法，利用所述的里氏木霉工程菌发酵，收集发酵液，获取衣康酸。

优选的是，发酵条件为：接种量为10⁸个孢子/50mL液体培养基，发酵温度为28-30℃，转速为200rpm。