[发明专利]一种生产衣康酸的里氏木霉工程菌的构建方法及应用

权利要求书

1.一种里氏木霉工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以不产衣康酸的丝状真菌里氏木霉菌或者里氏木霉菌来源的衍生菌为出发菌株，导入编码顺式乌头酸脱羧酶和线粒体三羧酸转运蛋白的外源基因，获得菌株I；

(2)过表达所述菌株I的内源膜转运蛋白，获取产衣康酸的里氏木霉工程菌。

2.如权利要求1所述的里氏木霉工程菌的构建方法，其特征在于，所述出发菌株包括里氏木霉菌QM6a，QM9414，Rut-C30，RL-P37，NG14以及PC-3-7。

3.如权利要求1所述的里氏木霉工程菌的构建方法，其特征在于，所述顺式乌头酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码所述顺式乌头酸脱羧酶的基因序列如SEQ IDNO.2所示；所述线粒体三羧酸转运蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码所述线粒体三羧酸转运蛋白的基因序列如SEQ ID NO.6所示。

4.如权利要求1所述的里氏木霉工程菌的构建方法，其特征在于，所述内源膜转运蛋白为mfs超家族转运蛋白；编码所述内源膜转运蛋白的基因包括mfs1、mfs2、mfs3、mfs4、mfs5，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14所示。

5.一种里氏木霉工程菌，其特征在于，由权利要求1-4任一项所述的构建方法构建而成。

6.一种生成衣康酸的方法，其特征在于，利用权利要求5所述的里氏木霉工程菌发酵，收集发酵液，获取衣康酸。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵条件为：接种量为10⁸个孢子/50mL液体培养基，发酵温度为28-30℃，转速为200rpm。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述液体培养基包括以下浓度组分：碳源50-100g/L，蛋白胨1-6g/L，KH₂PO₄ 0.15g/L，K₂HPO₄ 0.15g/L，CaCl₂·2H₂O 0.10g/L，MgSO₄·7H₂O 0.10g/L，碳酸钙20-40g/L，NaCl 0.05g/L以及1mL/L微量元素液。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述碳源包括葡萄糖、甘油、液化淀粉、纤维素、纤维素水解液中任一种；

所述微量元素包括以下重量的组分：1.6g MnSO₄·4H₂O，5g FeSO₄·7H₂O，2gCoCl₂·6H₂O，1.4g ZnSO₄·7H₂O，用水溶解并定容至1L。

10.如权利要求1-4任一项所述的构建方法，或权利要求5所述的里氏木霉工程菌在生产衣康酸中的应用。