[发明专利]基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺

说明书

本发明公开一种基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺，实现以涂片细胞形态学技术为基础结合免疫标记技术准确检测血液/骨髓涂片特定形态白血病细胞的免疫标记及诊断方法和工艺路线。将制备的三价镱离子和三价铒离子掺杂四氟钇钠上转换纳米颗粒经过修饰和抗体偶联制备出免疫荧光探针标记细胞用于细胞荧光场成像，结合瑞氏/瑞‑姬氏染液复染后明场成像的细胞形态，实现同一视野内涂片血液肿瘤细胞的形态特点及免疫标记特征协同检测、评估。稀土上转换材料免疫荧光探针特异性好、荧光信号强，为实现以细胞形态学为基础的血液肿瘤细胞联合免疫标记准确诊断血液/骨髓涂片血液肿瘤细胞提供了新方法。

技术领域

本发明涉及基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺，属于检测技术领域，该工艺可协同用于骨髓涂片血液肿瘤细胞的形态学观察、免疫标记和血液肿瘤类型的判断。

背景技术

白血病是血液系统的恶性疾病，俗称“血癌”，是国内十大高发恶性肿瘤之一，白血病的有效治疗依靠分析患者来源的血液肿瘤细胞进行分型诊断。世界卫生组织主张应用细胞形态学（Morphology）、免疫学（Immunology）、细胞遗传学（Cytogenetics）和分子生物学（Molecular）分型，即MICM分型。其中，细胞形态学和免疫标记检测是整个诊断体系最基础和最为重要的手段。

细胞形态学特征分析具有所见即所得的天然优势，但白血病细胞形成的内在因素复杂，细胞类型繁多，容易造成观察者误读误判。一些分化程度过低的细胞，细胞形态类别特征不突出，仅依靠形态学观察难以准确诊断，结合免疫标记则可大大提升诊断的准确性。稀土掺杂无机纳米晶具有独特的优势，如光稳定性好、信噪比高、易于生物偶联、生物相容性高、成本低等，作为新一代荧光标记材料用于CD抗体免疫标记具有广泛的应用前景。

本发明公开基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺，利用稀土离子掺杂四氟钇钠纳米颗粒偶联抗体制备免疫荧光探针用于白血病细胞荧光成像，结合瑞氏/瑞-姬氏染色后的细胞明场成像，实现了同一视野下涂片血液肿瘤细胞免疫标记-形态学协同检测评估。

发明内容

1.本发明的目的是建立一种基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺。

2.本发明所述的技术路线是指上转换荧光探针标记的免疫荧光细胞图联合瑞氏/瑞-姬氏染色后的细胞形态图，实现相同视野下骨髓涂片白血病细胞的准确分类和诊断。

本发明的目的是这样实现的，一种基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺，其特征在于，采用的免疫荧光探针为CD抗体偶联的三价镱离子和三价铒离子掺杂四氟钇钠上转换纳米颗粒，通过抗原-抗体识别能用于白血病细胞特异性免疫荧光成像，协同瑞氏/瑞-姬氏染色后的白血病细胞形态明场成像，能实现相同视野下骨髓涂片白血病细胞的准确诊断。

本发明所述的基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺，其特征在于，所述免疫荧光探针的制备方法，包括步骤如下：（1）上转换纳米材料的制备与修饰：在通氮气情况下，将含有Y³⁺的无机盐，Yb³⁺的无机盐，Er³⁺的无机盐和氟化氢钠在油酸和十八烯中反应，反应结束后分离得到纳米材料NaYF₄:Yb³⁺,Er³⁺UCNPs；所述纳米材料为晶体，晶格间距为0.52 nm，纳米颗粒尺寸为20～30 nm；所述纳米材料经过盐酸酸洗和聚丙烯酸修饰后得纳米材料混悬液、备用；（2）免疫荧光探针的制备与偶联：使用N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）加入步骤（1）得到的纳米材料混悬液，室温下混匀，加入适量抗体，继续室温下混匀，离心除去未结合抗体，得沉淀物，将沉淀物加入纯水中，超声后离心，制得纳米材料-CD38抗体偶联物，以牛血清白蛋白（BSA）封闭，所得免疫荧光探针溶解于4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液，于4℃冰箱中储存备用。