[发明专利]用于SFTSV等八种病原体联检的组合物及检测方法

权利要求书

1.一种引物和探针组合物，用于八种病原体的联合检测，所述八种病原体包括莫氏立克次体、Q热立克次体、恙虫病东方体、埃立克体、斑点热群立克次体、无形体、荆门病毒和新布尼亚病毒；

所述引物和探针组合物包括但不限于：

与莫氏立克次体的GroEL基因的核苷酸序列存在相同或互补序列的引物组MS-rF1、MS-rF2、MS-rR和探针r-probe；

与Q热立克次体的IS1111基因的核苷酸序列存在相同或互补序列的引物组QF-F1、QF-R1、QF-A-F、QF-A-R和探针QF-probe；

与恙虫病东方体的56KD的htrA基因的核苷酸序列存在相同或互补序列的引物组56KD-F、56KD-R和探针56KD-probe；

与埃立克体的GroEL基因的核苷酸序列存在相同或互补序列的引物组Eri-F1、Eri-R1、Eri-F2、Eri-R2和探针E-probe；

与斑点热群立克次体的190KD的基因的核苷酸序列存在相同或互补序列的引物组SFGR-F、SFGR-R和探针Rr190-probe；

与无形体的16S rRNA的核苷酸序列存在相同或互补序列的引物组Eh-1、Eh-2、Eh-3、Eh-4和探针H-probe；

与荆门病毒的S4片段的核苷酸序列存在相同或互补序列的引物组JMTV-F1、JMTV-R1、JMTV-F2、JMTV-R2和探针S4-probe；

与新布尼亚病毒的M片段的核苷酸序列存在相同或互补序列的引物组F1、R1、F2、R2和探针M3-probe；

所述引物和探针具有序列如序列表SEQ ID NO:1-35所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的引物和探针组合物，其特征在于：探针分别用磁珠标记后制备为检测微球，其中，所述探针r-probe、所述探针QF-probe、所述探针56KD-probe、所述探针E-probe、所述探针Rr190-probe、所述探针H-probe、所述探针S4-probe和所述探针M3-probe用任意选择的八个不同编号的磁珠分别进行标记。

3.根据权利要求1所述的引物和探针组合物，其特征在于：与所述Q热立克次体对应的引物组、与所述埃立克体对应的引物组、与所述无形体对应的引物组、与所述荆门病毒对应的引物组和与所述新布尼亚病毒对应的引物组为巢式PCR引物组；与所述莫氏立克次体对应的引物组为不对称半巢式引物组。

4.一种八种病原体联合检测的液相芯片，其特征在于：包含标准物质、阴性对照和权利要求1-3任一项中所述的引物和探针组合物。

5.根据权利要求4所述的八种病原体联合检测的液相芯片，其特征在于：所述液相芯片的检测范围为1×10¹到1×10⁶。

6.一种八种病原体联合检测的液相芯片非诊断性检测方法，其特征在于：所述方法包含参与反应的权利要求1-3任一项中所述的引物和探针组合物；检测步骤为：

检测微球：取磁珠振荡超声后，和所述探针充分振荡偶联形成检测微球；

PCR反应体系：制备25μL反应体系，包括DNA 1.0μL、PCR预混液12.5μL、上下游引物(10μM)各0.5μL、去离子水；阴性对照中所述DNA用水代替；

PCR扩增反应：98℃预变性5min，98℃30s，58℃30s，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸5min；

杂交反应体系：检测微球各0.5μL、33μL 1.5×TMAC、12μLTE、PCR产物5μL；

杂交反应：95℃变性5min，55℃-58℃杂交10-15min；

检测微球标记：在上述杂交液中，加入50μg/mL的链霉素亲和素和R-藻红蛋白偶联物10μL，55℃反应10min；

结果检测：将上述反应液转移至96孔版，使用液相芯片悬浮仪进行检测。

7.根据权利要求6所述的八种病原体联合检测的液相芯片非诊断性检测方法，其特征在于：所述磁珠选用MagPLEX磁珠。