[发明专利]一种高灵敏度多真菌毒素同步快检方法

说明书

本发明涉及毒素快检技术领域，并公开了一种高灵敏度多真菌毒素同步快检方法，包括以下步骤：S1、准备快检器材与试剂；S2、伏马毒素完全抗原的合成；S3、伏马毒素的动物免疫与杂交瘤细胞的制备；S4、伏马毒素阳性杂交瘤筛选方法；S5、伏马毒素抗体的生产；S6、伏马毒素的酶联免疫吸附方法的建立；S7、纳米金探针的制备；S8、灰度成像纳米金试纸条的检测。本发明所提出的多真菌毒素同步快检方法表明伏马毒素为迄今报道灵敏度最高，为快速检测技术提供了高质量核心生物识别材料，在未来发展方向中，纳米抗体可通过体外亲和力定向改造与结构功能化进一步提高亲和力，拓展新的检测方法与检测模式。

技术领域

本发明涉及毒素快检技术领域，尤其涉及一种高灵敏度多真菌毒素同步快检方法。

背景技术

真菌毒素是一类由真菌产生的次级代谢产物，对脊椎动物和其他生物具有毒性作用，丝状真菌可产生上千种有毒成分，其中最重要的为曲霉属真菌、镰刀菌属和青霉菌属(MOSS，1996)，目前在已鉴定出的400余种真菌毒素中,最受毒理学和立法机构关注的有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、单端孢霉烯族毒素(伏马毒素、呕吐毒素、T-2毒素、HT-2毒素、二乙酰镳草镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮)，展青毒素、橘霉素和麦角碱，真菌毒素污染范围广，主要污染谷物、干果、红酒、牛奶、咖啡豆、可可粉、肉类等农产品，这些农产品大多数为发展中国家的基本经济作物。

真菌毒素标准检测方法通常是在经过认证的实验室采用精密仪器，如高效液相色谱-荧光或者高效液相色谱-质谱等，这些方法虽然能够提供准确的检测结果，但设备昂贵，时间成本高、且需专业技术人员，而目前真菌毒素污染态势逐渐加重，污染常常发生在种植、收获、储藏、运输、加工等各个环节，仅通过大型仪器实现对农产品中真菌毒素污染情况进行有效监控难度较大，为保证农产品从田间到餐桌的安全，阻止真菌毒素进入食物链，亟需低成本小型仪器和快速检测方法用于产前、产中、产后各环节的毒素筛查与监测,基于分子识别生物传感器及传感方法是目前在食品安全快速检测领域备受关注的研究方向之一。

所以，需要设计一种高灵敏度多真菌毒素同步快检方法来解决上述问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种高灵敏度多真菌毒素同步快检方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种高灵敏度多真菌毒素同步快检方法，包括以下步骤：

S1、准备快检器材与试剂；

S2、伏马毒素完全抗原的合成；

S3、伏马毒素的动物免疫与杂交瘤细胞的制备；

S4、伏马毒素阳性杂交瘤筛选方法；

S5、伏马毒素抗体的生产；

S6、伏马毒素的酶联免疫吸附方法的建立；

S7、纳米金探针的制备；

S8、灰度成像纳米金试纸条的检测。

作为本发明的一种优选技术方案，所述快检器材包括眼科用剪刀、镊子、200目尼龙细胞过滤筛网、玻璃吸管、针头、吸水纸、无菌一次性六孔细胞培养板、无菌培养皿、血球计数板；所述试剂包括醋酸盐缓冲溶液、PBS缓冲溶液、四氯金酸缓冲溶液、柠檬酸三钠溶液、碳酸钾溶液与标记封闭液。

作为本发明的一种优选技术方案，所述伏马毒素完全抗原的合成采用戊二醛法合成FB-BSA及FB-OVA，步骤如下:将摩尔浓度为15mmol/L的BSA蛋白溶液与0.738mmol/L的FB,溶液混合在PBS缓冲液(0.01molL)中，搅拌状态下逐滴加入浓度为2％(v/v)的戊二醛溶液，室温反应1h，向混合溶液中加入硼氢化纳还原剂，还原未反应完的醛基，最后得到透明溶液，用PBS溶液透析三天，10000pm离心20min，收集上清，测定浓度，FB-OVA的制备方法同FB-BSA。