[发明专利]一种高灵敏度多真菌毒素同步快检方法

权利要求书

1.一种高灵敏度多真菌毒素同步快检方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、准备快检器材与试剂；

S2、伏马毒素完全抗原的合成；

S3、伏马毒素的动物免疫与杂交瘤细胞的制备；

S4、伏马毒素阳性杂交瘤筛选方法；

S5、伏马毒素抗体的生产；

S6、伏马毒素的酶联免疫吸附方法的建立；

S7、纳米金探针的制备；

S8、灰度成像纳米金试纸条的检测。

2.根据权利要求1所述的一种高灵敏度多真菌毒素同步快检方法，其特征在于，所述快检器材包括眼科用剪刀、镊子、200目尼龙细胞过滤筛网、玻璃吸管、针头、吸水纸、无菌一次性六孔细胞培养板、无菌培养皿、血球计数板；所述试剂包括醋酸盐缓冲溶液、PBS缓冲溶液、四氯金酸缓冲溶液、柠檬酸三钠溶液、碳酸钾溶液与标记封闭液。

3.根据权利要求1所述的一种高灵敏度多真菌毒素同步快检方法，其特征在于，所述伏马毒素完全抗原的合成采用戊二醛法合成FB-BSA及FB-OVA，步骤如下:将摩尔浓度为15mmol/L的BSA蛋白溶液与0.738mmol/L的FB,溶液混合在PBS缓冲液(0.01molL)中，搅拌状态下逐滴加入浓度为2％(v/v)的戊二醛溶液，室温反应1h，向混合溶液中加入硼氢化纳还原剂，还原未反应完的醛基，最后得到透明溶液，用PBS溶液透析三天，10000pm离心20min，收集上清，测定浓度，FB-OVA的制备方法同FB-BSA。

4.根据权利要求1所述的一种高灵敏度多真菌毒素同步快检方法，其特征在于，所述伏马毒素的动物免疫与杂交瘤细胞的制备的步骤如下：(1)将100ug的FB,-BSA溶于0.2mL灭菌的0.85％NaC1溶液中，用等体积的弗氏佐剂乳化后多点注射于小鼠背部皮下；(2)两周后，用100ug的FB-BSA与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，注射于小鼠腹部，随后每隔两周对小鼠进行一次免疫，共免疫四次；(3)从第三次免疫开始，免疫一周后取小鼠尾部静脉血，采用ELISA方法对小鼠血清效价和特异性进行检测；(4)在第四次免疫后，细胞融合前3天对小鼠血清滴度和灵敏度最高的小鼠进行冲刺免疫，(5)在无菌条件下，将滴度最高、特异性最好的小鼠脾脏取出，将脾细胞(1×108〉和新分离的SP2/0骨髓瘤细胞(1×107)在50％PEG1450下进行融合；(6)将融合后的杂交瘤细胞在选择性半固体完全培养基中培养，两周后，将半固体培养基中的单个细胞克隆转移到96孔液体培养基中，采用竞争ELISA方法对细胞上清液进行测定，将阳性克隆继续用96孔细胞培养板进行传代培养,继续采用竞争ELISA方法进行淘选,逐轮降低FB,标准品浓度，筛选出可灵敏识别靶标物的阳性杂交瘤细胞株。

5.根据权利要求1所述的一种高灵敏度多真菌毒素同步快检方法，其特征在于，所述伏马毒素阳性杂交瘤筛选方法的步骤如下：(1)采用包被液稀释FB-OVA到适当浓度,在酶标孔中每孔加入100uL,37℃孵育2h,PBST洗涤3次，在滤纸上拍干；(2)采用4％的脱脂奶粉﹐每个酶标孔加入200uL进行封闭,37℃孵育1h,PBST洗涤3次，在滤纸上拍干；(3)将血清采用PBS稀释成系列浓度，50uL与PBS混合加入微孔，读取的吸光值记为Boo另外50uL与一定浓度的FB混合加入另外一个微孔，读取的吸光值记为B，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，在滤纸上拍干；(4)将HRP-羊抗鼠IgG稀释为1:5000倍，加入酶标孔中，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，在滤纸上拍干；(5)加入显色液和终止液，37℃孵育10min，加入终止液终止反应；(6)将酶标仪测定波长调成450nm，测定OD值，选择1-B/B,0.5作为阳性杂交瘤。