[发明专利]一种人五毛滴虫LFD-RPA的可视化核酸检测试剂盒

说明书

本发明公开一种人五毛滴虫LFD‑RPA的可视化核酸检测试剂盒，根据人五毛滴虫SPO11‑1基因序列设计出可快速有效检测出人五毛滴虫的引物及探针组合，并通过建立RPA扩增技术结合侧流层析试纸条法，用于临床上人五毛滴虫的特异、敏感和快速检测，为样品中人五毛滴虫的快速可视化现场检测提供了有效的技术手段，尤其适用于实验设备较为落后的基层检测实验室和疫情突发现场。本发明的引物和探针特异性强，对人五毛滴虫基因组DNA检出限为5拷贝数/ul，操作简单且快捷，无需特殊仪器，反应温度与温室接近，可肉眼观察结果，有利于实现实验室及现场人五毛滴虫的快速检测与监测，在粪便污染防控预警方面具有很高的应用价值。

技术领域

本发明公开一种人五毛滴虫LFD-RPA的可视化核酸检测试剂盒，本发明还提供了该试剂盒的检测方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

人五毛滴虫（Pentatrichomonas hominis）是呈世界性分布的一类人兽共患寄生虫，主要寄生在人和脊椎动物的结肠和盲肠内。人五毛滴虫感染引起以腹泻为主要症状的人五毛滴虫病，感染后还会导致肺部感染、风湿性关节炎等疾病，且人五毛滴虫感染与胃肠道癌症有密切关系。目前诊断动物感染人五毛滴虫的方法主要包括直接涂片镜检法、染色镜检法、PCR检测法等。但镜检法检出率不高。PCR检测法需要借助一些特殊的实验器械且步骤复杂。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification RPA)是近年来发展起来的一种快速诊断的方法，已广泛用于病毒、细菌、寄生虫诊断中。RPA利用重组酶可与引物紧密结合，形成重组酶-引物复合物，促进引物与DNA双链的同源靶序列的结合，DNA聚合酶进行新链的合成，整个过程仅需在37-42℃下反应10-30分钟即可。与PCR方法相比，整个过程不需要高温变性和低温退火步骤，操作简单，时间较短。重组酶聚合酶扩增侧流层析技术(LFD-RPA)是RPA技术结合侧流层析试纸条(LateralflowdipsticksLFD)建立的一种现场快速检测系统，特别适用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。目前，尚无动物人五毛滴虫感染LFD-RPA的可视化核酸检测方法的报导。

发明内容

本发明公开了一种人五毛滴虫LFD-RPA的可视化核酸检测试剂盒，以RPA等温扩增技术原理结合侧流层析试纸条建立动物人五毛滴虫感染核酸检测技术，不依赖大型仪器，实现快速、易操作的检测。

本发明所述的一种人五毛滴虫LFD-RPA的可视化核酸检测试剂盒，其特征在于：

1）试剂盒中包括含RPA冻干颗粒的反应管、反应缓冲液A Buffer、扩增试剂BBuffer、两对引物和探针以及ddH₂O和侧流层析试纸条；其中：

所述RPA冻干颗粒反应管的组分包括：重组酶、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、dNTP以及外切酶；

所述的两对引物及探针如下：

上游引物：5'-ATAGTGGTGGACGAGCCCTGGATTGCCTTG-3'；

下游引物：5'-Biotin-CTTGTGCCAATCTCATAAAAACGCTCTCCT-3；

探 针：5'-[6-FAM]-GACGTGTAGTTCCAATACCAGCTTCACCAGATGG[THF]CA TAAAAGCAGTTAGATGTACA-[C3 Spacer]-3'；

在RPA试剂盒中的终浓度为2μM；

2）试剂盒中还应包含：阳性对照的DNA 模板为感染人五毛滴虫粪便基因组DNA；阴性对照的为未感染人五毛滴虫粪便基因组DNA，用于比较RPA产物以及监测RPA操作过程是否有污染；

所述试剂盒25μL反应体系如下：12.25μL的A Buffer，2μM上下游引物各0.6μL，2μM探针0.25μL，ddH₂O7.55μL，待检人五毛滴虫DNA模板2.5μL及1.25μL的B Buffer。 1）