[发明专利]表达FcγRIIIa和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞的构建方法及应用

说明书

本发明提供一种表达FcγRIIIa和NFAT‑Luc报告基因的Jurkat细胞的构建方法，其特征在于，通过构建NFAT‑Luc以及FcγRIIIa的慢病毒表达质粒载体，将慢病毒表达质粒载体配合慢病毒包装质粒分别转染至293v细胞中，获得携带有FcγRIIIa或NFAT‑Luc的病毒颗粒；再感染Jurkat细胞而成。还公开了制得的Jurkat细胞及应用。本发明构建了稳定表达FcγRIIIa（CD16a）受体和由NFAT应答元件驱动表达的萤火虫萤光素酶的效应细胞Jurkat/NFAT/FcγRIIIa，可用于检测抗体药物的ADCC生物学活性。

技术领域

本发明专利涉及一种表达FcγRIIIa和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞的构建方法、构建的细胞及应用，属于生物技术领域。

背景技术

抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity, ADCC）是免疫系统对抗病毒感染及肿瘤疾病的一种重要免疫防御机制，是指表达Fc受体的免疫细胞通过识别抗体的Fc段直接杀伤与抗体特异性结合的靶细胞的作用。抗体通过与靶细胞表面抗原特异性结合，招募如自然杀伤（Natural killer, NK）细胞等效应细胞杀死靶细胞。NK细胞表面表达FcγRIIIa蛋白，是一种抗体Fc区域的受体，能识别并结合抗体的Fc端，从而使NK细胞结合到靶细胞周围。一旦Fc受体与抗体的Fc区域结合，NK细胞就会释放细胞因子和细胞毒性颗粒，进入靶细胞触发细胞凋亡。传统的ADCC检测方法是利用外周血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cells, PBMC）或自然杀伤（NK ）细胞亚群作为效应细胞进行检测，该方法的效应细胞难于制备，操作繁琐，且应答变异性很大，并容易引起很高的背景读数。

鉴于此，为了解决目前本领域面临的上述问题，基于ADCC这一机制，本发明构建了工程化Jurkat 细胞作为效应细胞用于ADCC效应的检测，可用来检测、评定抗体或靶细胞的功效。本发明构建的Jurkat 细胞株能够稳定表达FcγRIIIa（高亲和V158）受体和由 NFAT应答元件驱动表达的萤火虫萤光素酶。 抗体在 ADCC 作用机制中的生物活性通过 NFAT通路活化产生的萤光素酶进行定量，效应细胞中的萤光素酶活性通过生物发光读数定量，检测的信号值高，且背景很低。本发明能够满足ADCC实验要求，检测结果稳定，准确度高，实验程序操作简便，对于单克隆抗体产品的批次放行和稳定性检测具有很好的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于ADCC效应检测的Jurkat细胞株。

本发明提供了一种表达FcγRIIIa和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞的构建方法，包括如下步骤：

(1) 构建NFAT-Luc的慢病毒表达质粒载体，以及FcγRIIIa 的慢病毒表达质粒载体，其中FcγRIIIa基因序列如SEQ ID No.2所示；

(2) 将步骤(1)中所述的两种慢病毒表达质粒载体配合慢病毒包装质粒分别转染至293v细胞中，获得携带有FcγRIIIa或NFAT-Luc的病毒颗粒；

(3) 用携带FcγRIIIa的病毒颗粒感染Jurkat细胞；

(4) 对流式细胞仪筛选得到的阳性细胞株进行博来霉素加压筛选；

(5)用携带NFAT-Luc的病毒颗粒感染步骤（4）筛选出的Jurkat细胞；

(6)对流式细胞仪筛选得到的阳性细胞株进行嘌呤霉素加压筛选；

(7) 加压筛选后的细胞进行单克隆化，筛选出单克隆阳性细胞株。

优选的，步骤（2）中慢病毒包装质粒为psPAX2和pMD2.G，慢病毒表达质粒载体：psPAX2：pMD2.G的质量比为1:1:1。

优选的，步骤(2)中所述转染的方式为化学转染法，所用转染试剂为阳离子聚合物PEI，具体包括如下步骤；