[发明专利]表达FcγRIIIa和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞的构建方法及应用

权利要求书

1.一种表达FcγRIIIa和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1) 构建NFAT-Luc的慢病毒表达质粒载体，以及FcγRIIIa 的慢病毒表达质粒载体，其中FcγRIIIa基因序列如SEQ ID No.2所示；

(2) 将步骤(1)中所述的两种慢病毒表达质粒载体配合慢病毒包装质粒分别转染至293v细胞中，获得携带有FcγRIIIa或NFAT-Luc的病毒颗粒；

(3) 用携带FcγRIIIa的病毒颗粒感染Jurkat细胞；

(4) 对流式细胞仪筛选得到的阳性细胞株进行博来霉素加压筛选；

(5)用携带NFAT-Luc的病毒颗粒感染步骤（4）筛选出的Jurkat细胞；

(6)对流式细胞仪筛选得到的阳性细胞株进行嘌呤霉素加压筛选；

(7) 加压筛选后的细胞进行单克隆化，筛选出单克隆阳性细胞株。

2.根据权利要求1所述的表达FcγRIIIa和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞的构建方法，其特征在于：步骤（2）中慢病毒包装质粒为psPAX2和pMD2.G，慢病毒表达质粒载体：psPAX2：pMD2.G的质量比为1:1:1。

3.根据权利要求1所述的表达FcγRIIIa和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞的构建方法，其特征在于：步骤(2)中所述转染的方式为化学转染法，所用转染试剂为阳离子聚合物PEI，具体包括如下步骤；

（1）转染前一天按5E6 cells进行10 cm Dish铺板，培养基为含10% FBS DMEM，接种细胞24 h后，293v细胞的汇合度为75%-85%；

（2）转染前4小时，将细胞培养基换为5 ml的无血清DMEM；

（3）将10 μg质粒DNA 与0.5 mL DMEM混匀后，加入20 μL PEI（PEI:DNA=2:1）转染试剂，涡旋混匀10 秒，室温静置15 min，形成DNA-PEI 复合物；

（4）将转染复合物加入到无血清培养基细胞中，轻轻混匀，于37℃，5% CO₂培养箱中培养；

（5）转染结束4 h后换成10 mL含10% FBS DMEM继续培养；

（6）转染48 h后收获病毒上清，离心条件为4℃，3000 g，30 min。

4.根据权利要求1所述的表达FcγRIIIa和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞的构建方法，其特征在于：步骤（3）或（5）具体为：

（1）收集Jurkat细胞，1000 rpm，5 min离心后，加入1-2 mL完全培养基重悬细胞，计数，用完全培养基调整至2E6 cells/mL的细胞工作液，并加入polybrene，使其终浓度为30 μg/mL；

（2）取100 μL的Jurkat细胞工作液加入24孔板中，加入200 μL携带有FcγRIIIa或NFAT-Luc的病毒上清，混匀后置于37℃，5% CO₂培养箱中孵育2-3 h后，补充完全培养基至2mL；

（3）将24孔板放入37℃、5% CO₂培养箱中继续培养72 h。

5.根据权利要求1所述的表达FcγRIIIa和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞的构建方法，其特征在于：步骤(4)中博来霉素和步骤（6）中嘌呤霉素的浓度分别为250 μg/mL、0.3 μg/mL。

6.权利要求1-5中任一项所述的表达FcγRIIIa和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞的构建方法获得的表达FcγRIIIa和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞。

7.权利要求6所述的表达FcγRIIIa和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞在检测ADCC效应中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于其步骤包括：

（1）将抗CD20单克隆抗体样品预稀释到3 μg/mL初始工作浓度，再进行等比例稀释；

（2）将步骤(2)中稀释后的抗CD20单克隆抗体样品加入到一定比例的效应细胞和靶细胞中，于37℃，5% CO2培养箱加湿孵育，所述效应细胞为表达FcγRIIIa和NFAT-Luc报告基因的Jurkat细胞，所述靶细胞为Raji细胞；

（3）加入荧光底物，室温孵育5 min后，酶标仪进行读数。